ELISA实验的影响因素及问题分析

ELISA实验的影响因素及问题分析

湖北省应城市中医医院检验科432400

摘要:ELISA实验的结果受操作影响很大,每个步骤包括加样,温育,洗涤,显色,酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏,强特异的优点。因此,应建立实验项目的标准操作程序(SOP)。

关键词:ELISA;实验;影响因素;问题分析

1971年Engvall等人把免疫组化的EIA技术应用于临床检验发展为ELISA技术。其特点为灵敏度和特异性相对较高,现广泛应用于乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等的检测,现就我多年的实验经验,浅谈整个ELISA实验过程中的影响因素及问题分析。

实验前检验人员需知

首先检验人员需经过培训,熟练掌握本专业如下几方面的技术知识:

1、检验项目的基本原理(ELISA原理)及临床意义

2、熟悉检测技巧,了解易出差错的环节及难点;

3、熟悉检测试剂性能(包括试剂的灵敏度,特异性,精密度,稳定性,安全性等);

4、熟悉检测仪器的原理及性能;为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序(SOP),所要控制的仪器包括移液器(加样枪),水浴箱(温箱),洗板机和酶标仪。酶标仪应经常维护其光学部分,防止滤光片霉变,定期检测校正,使其保持良好的工作性能。

5、某些特殊项目的检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班,考试合格后持证上岗。

标本的采集和保存

1、可用作ELISA的标本十分广泛,体液(如血清,血浆,各种积液),分泌物(如唾液)和排泻物(如粪便,尿液)均可作为标本以测定其中的抗原或抗体成份,一般使用血清。

2、标本采集时应尽量避免溶血,因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果,可造成假阳性;长菌的标本同样的道理易产生假阳性。

3、抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性,建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂的抗凝血。。

4、标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合,使间接法的试剂本底加深。一般血清置4℃冰箱应5天内完成测试。如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存,血清融解时应上下颠倒充分混匀,同时避免气泡。

5、ELISA的灵敏度应>1ng/ml水平上,标本间的污染要尽量避免,尤其不应与生化试验用同一管标本,最起码应先做免疫后做生化。

实验过程中易出现的问题及分析

1、漏加阳性对照;阳性对照孔忘加酶或忘加显色剂;阳性对照受污染均可引起阳性对照不显色.

2、试剂保存不当或活性下降;在使用前试剂盒未放置在室温平衡温育或时间不够或孵育温度过低,洗板浸泡时间过长、洗板次数过多;使用不正确的洗液;洗液中含有防腐剂同时残留量过多;洗板后酶标板被干透;读数时使用波长不正确;滤光片不清洁或滤光片位置错误;读数时酶标板放置位置错误;阳性对照活性下降;酶标失活均可引起阳性对照显色浅(HBeAbHBcAb阴性对照显色浅).

3、加入标本后未进行必要的混匀;标本稀释错误;加样量不正确;冷冻标本未完全溶解混匀;标本中含有防腐剂均可引起阳性对照读数不正常.

4、实验器具被污染;血清中出现纤维蛋白凝集;血清标本中出现过多的红细胞;

血浆标本处理不当;标本中含有灰尘、颗粒或细菌等;标本被反复冻融;加标本后进行不正确的振荡;沿孔壁上加入标本,加样后出现过多的气泡;酶标滴加在孔壁上,洗板未洗净;混用洗液或洗液稀释错误;洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌;洗板次数不足或浸泡时间短;洗板时洗液量少或残留量多;洗板时洗液量过多、串孔;读数时酶标板底部有水蒸气凝结;洗液瓶、废液瓶混用;读数过程中板孔中有气泡;酶标仪偏差均可引起假阳性结果。

5、实验过程受污染;阴性对照污染;酶滴在孔壁上均可引起阴性对照显色(HBeAb、HBcAB除外).

6、试剂和保存不当、已经失活;忘记加酶、可检查滴瓶内酶量;忘记加抗原或中和试剂;忘记加显色剂A或显色剂B均可引起整板不显色。

7、试剂盒灵敏度高;加样时使用同一枪头、交叉污染;孵育时间过长或温度过高;洗板次数不足,浸泡时间短;洗板时洗液量少或残留量多;洗板时洗液量过多、串孔;洗板机管道中有霉菌生长;洗液瓶混用;洗板机洗板头阻塞或洗板机洗板头位置错误;配置洗液的去离子水或蒸馏水被污染;终止液浓度不够,没有充分混匀,或终止液被污染;读数时酶标板底部有水蒸气凝结;酶标仪偏差均可引起血清本底高。

8、标本混匀不充分;试剂混匀不充分;标本与酶结合物混匀不充分;加样技术差异;加样器故障或加样器被污染;加样时间过长导致孵育时间不同;孵育器内部的温度不一致,造成酶标板孔间的孵育温度差异;读数时酶标板孔间有气泡均可引起同一板内重复性差。

参考文献:

[1]曹文飞.酶联免疫测定的干扰因素与对策1998,10(03).

[2]曾真赵祥胜.乙型肝炎血清学标志间非特异性交叉反应的研究1995,18(04).

[3]FernandoSAwilsonGS.Studiesofthehookeffectintheone-stepsandwichimmunoassay1992,151(1-2).

[4]BoscatoLMStuartMC.Incidenceandspecificityofinterferenceintwo-siteimmunoassays1986,32.

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