导读:本文包含了中枢保护作用论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:中枢,细胞,神经,激酶,炎症,苦参碱,饮子。
中枢保护作用论文文献综述
顾志荣,许爱霞,李芳,祁梅,马天翔[1]（2019）在《基于PI3K/Akt信号通路研究中药及其活性成分的中枢神经保护作用最新进展》一文中研究指出PI3K/Akt信号通路激活所介导的具有中枢神经保护作用的中药非常广泛,但主要分布在补益药、清热药及活血药中,其中尤以补益类中药的苷类及多糖类成分、清热类中药的生物碱类成分为目前研究的热点。基于PI3K/Akt信号通路的中药及其活性成分的中枢神经保护作用作用研究,为相关中枢神经保护剂及PI3K/Akt通路激活剂的开发提供了进一步的实验依据,对神经系统功能障碍性疾病新的、安全的治疗方案与思路开发具有广阔的前景。但目前多数研究对PI3K/Akt通路的下游信号蛋白如Bcl-2,Bax,p21,p-mTOR,p53,Caspase-9,e NOS等关注较多,而对上游蛋白仅对PI3K,Akt,c AMP,PKA,p-PDK等有所研究,对有效部位或有效部位群等中药提取物作为PI3K/Akt信号通路激活剂来保护中枢神经的相关研究较少。(本文来源于《中国新药杂志》期刊2019年13期）
王婧[2]（2019）在《羟基法舒地尔对MOG及CPZ诱导的中枢神经系统脱髓鞘小鼠模型的神经保护作用及机制研究》一文中研究指出Rho/ROCK信号通路参与多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomylitis,EAE)的病理过程,在免疫细胞活化、炎性细胞经破坏的血-脑屏障(blood brain barrier,BBB)向中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)迁移、髓鞘脱失、轴索损害以及胶质细胞反应等方面扮演着重要的角色。盐酸法舒地尔(Fasudil)是目前临床用于治疗蛛网膜下腔出血后血管痉挛的Rho激酶(Rho kinase,ROCK)抑制剂。有研究表明盐酸法舒地尔具有改善EAE免疫炎性微环境、保护髓鞘等作用,且具备促进神经突触再生的能力和内源性神经干细胞动员的潜能。但是,盐酸法舒地尔同时存在着迅速明显的血管扩张作用、长期使用安全窗较小且给药途径单一、口服生物利用度差、半衰期短等局限性。因此寻求和研发更有效、更安全且副作用更小的新型ROCK抑制剂来治疗神经系统慢性病的任务就显得越来越迫切。羟基法舒地尔(Hydroxyfasudil,HF)是盐酸法舒地尔在体内的活性代谢产物,活性比盐酸法舒地尔强,半衰期更长,并且作为ROCK抑制剂,HF具有更高的选择性。动物实验表明其在恶性肿瘤、肺动脉高压、心脑血管痉挛、心肌缺血、缺血性脑损伤等疾病的预防和治疗中具有潜在价值。因此,在本研究中首先于细胞水平检验HF的细胞毒性、对神经元活性以及形态的影响;其次,通过小鼠急性毒性实验,验证其安全性并了解HF的最大耐受剂量(Maximum Tolerance dose,MTD);继之,在EAE模型验证HF的临床有效性;最后,比较HF以及盐酸法舒地尔在双环己酮草酰二腙(Cuprizone,CPZ)诱导的CNS脱髓鞘模型的疗效,并研究HF对髓鞘的保护以及促进髓鞘再生的作用,探讨其可能的作用机制。第一部分羟基法舒地尔的细胞毒性及其对SHSY-5Y神经元细胞活性、形态的影响目的:观察并比较HF及盐酸法舒地尔的细胞毒性及其对SHSY-5Y神经元细胞活性和形态的影响。方法:SHSY-5Y(人源多巴胺神经细胞系)经标准程序复苏后进行常规培养和传代。待生长状态和细胞密度合适时进行药物干预实验,将神经元与不同浓度的HF及盐酸法舒地尔(3μg,15μg,75μg,200μg/ml)共同培养24h。神经元的活性采用MTT比色法检测。对神经元的细胞毒性测定采用LDH酶标法。SHSY-5Y神经元与HF、盐酸法舒地尔共培养24h后,在显微镜下观察培养状态中的神经元的形态。结果:1.同PBS对照组相比,相对低浓度(3μg/ml,15μg/ml)的HF及盐酸法舒地尔的细胞毒性不显着,随着药物浓度的增加,对SHSY-5Y神经元的毒性增加,特别是当浓度达到200μg/ml时,与PBS组相比,P<0.05,差异具有统计学意义。HF与盐酸法舒地尔组间无显着差异。2.同PBS对照组相比,相对低浓度(3μg/ml,15μg/ml)的HF及盐酸法舒地尔并不影响细胞活性,但是当浓度增加至75μg/ml,200μg/ml时SHSY-5Y神经元活性降低,P<0.05,差异具有统计学意义。HF与盐酸法舒地尔组间无显着差异。3.相对低浓度(3μg/ml)的HF和盐酸法舒地尔未明显影响SHSY-5Y神经元的形态,当浓度增至15μg/ml时可有效促进神经突的形成,而当浓度增至75μg/ml时可见神经突受损。结论:HF在体外实验中表现出较好的安全性,与盐酸法舒地尔相比无显着差异。第二部分羟基法舒地尔对小鼠的急性毒性实验目的:观察HF对小鼠的急性毒性,评价药物的安全性。方法:第一部分:将36只C57BL/6小鼠(8-10周龄,20-22g)随机分为6组(雌雄各半),即盐酸法舒地尔-80、100、125mg/kg和HF-80、100、125mg/kg。将HF和盐酸法舒地尔溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,使用前用0.1%冰醋酸稀释,腹腔注射。DMSO的最终浓度为10%(v/v)。观察小鼠的毒性反应,包括皮毛、进食情况、大小便情况、自主运动情况及不自主运动症状、死亡情况等。第二部分:为了排除酸性溶剂对实验结果的影响,重复100mg/kg和125mg/kg两个浓度组的实验。将16只C57BL/6小鼠随机分成4组(雌雄各半),使用0.9%Na Cl溶解盐酸法舒地尔,HF溶解方法同前。观察小鼠的毒性反应,包括皮毛、进食情况、大小便情况、自主运动情况及不自主运动症状、死亡情况等。结果:1.第一部分实验结果显示:随着药物浓度的增加,小鼠的自主运动逐渐减少,呼吸频率增加,双后肢紧贴地面,无法站立。与HF组相比,相同浓度的盐酸法舒地尔组小鼠自主运动较少,不自主运动增加,抽搐发生率和死亡率较高。盐酸法舒地尔-125mg/kg组小鼠在药物注射2分钟后出现惊厥,随后全身僵硬,然后死亡;相同浓度的HF组小鼠仅表现为自主运动减少,并且没有出现抽搐和死亡现象。2.第二部分结果显示:盐酸法舒地尔-125mg/kg(0.9%Na Cl溶解)组中的两只小鼠在注射药物5分钟后出现惊厥,呼吸速率加快并于30分钟后死亡。其余两只小鼠表现出较少的自主运动,双后肢不能站立。HF-125mg/kg(DMSO+0.1%冰醋酸溶解)组小鼠除了自主活动轻度减少以外,并没有出现抽搐和死亡现象。结论:HF的最大耐受剂量大于125mg/kg,说明HF较盐酸法舒地尔毒性更低,安全性更高。第叁部分羟基法舒地尔对实验性自身免疫性脑脊髓炎的防治作用及机制研究目的:建立髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)35-55诱导的EAE小鼠模型,观察HF在EAE模型中的治疗效果,并探讨其可能的分子机制。方法:EAE模型由MOG35-55多肽免疫雌性C57BL/6小鼠制备。随机分为EAE组、HF治疗组。HF于免疫后第3天开始腹腔注射(40mg/kg/d)直至第28天。期间观察小鼠行为学变化。免疫后第28天,取脊髓制备冰冻切片行组织学检测:苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色、卢卡斯快蓝(Luxol Fast Blue,LFB)染色。提取脊髓组织蛋白,通过Western blot法检测NF-κB、COX-2、i NOS的表达。制备脾单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs),应用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群;收集MNCs培养上清液,应用ELISA法检测细胞因子;应用Real-time PCR法检测脾MNCs中趋化因子的表达,以及脊髓中M1、M2型巨噬细胞标志物指标。在另一项实验中,建立EAE模型,于免疫后第9天,取脾脏制备MNCs,应用MOG刺激,与HF共培养,检测脾MNCs培养上清液中炎性细胞因子的浓度。结果:1.行为学变化:免疫后第12天EAE组小鼠陆续出现运动功能障碍,平均发病时间为免疫后(16.38±4.98)天,且随时间延长,临床症状加重,评分逐渐增高,EAE组小鼠的临床症状的平均最高分值为(3.84±1.09)分,HF治疗组小鼠则未出现可测的运动障碍表现,两组之间差异显着(P<0.01,P<0.001)。2.组织学检测:脊髓冰冻切片HE染色显示:EAE小鼠脊髓白质内大量炎性细胞密集环绕于小血管周围,呈血管“袖套样”改变。EAE组炎性细胞浸润面积占白质总面积的(1.15±0.09)%,HF治疗组为(0.64±0.18)%,炎性细胞的浸润明显减少,两组比较有统计学意义(P<0.01)。LFB染色可见EAE小鼠脊髓白质内片状髓鞘脱失区。EAE组髓鞘脱失区占白质总面积的(1.20±0.16)%,HF治疗组为(0.37±0.02)%,显着减少了脊髓白质内髓鞘的脱失(P<0.01)。3.流式细胞术检测HF对EAE小鼠脾MNCs中T淋巴细胞亚群变化的影响。结果显示,与EAE组相比,HF可上调CD4+CD25+T细胞的比例(P<0.05);下调CD4+IFN-γ+(P<0.05)和CD4+IL-17+T(P<0.05)细胞的比例。同时,与EAE组相比,HF可抑制脾MNCs培养上清液中IFN-γ和IL-17的表达(P<0.05)。4.Real-time PCR检测巨噬细胞标志物的表达,结果显示,与EAE组相比,HF增加了M2型巨噬细胞标志物Arg-1(P<0.05)、IL-4(P<0.01)、TGF-β(P<0.01)的表达,并抑制M1型巨噬细胞标志物i NOS(P<0.001)、CD68(P<0.001)和TNF-α(P<0.001)的表达。5.HF抑制了EAE小鼠脊髓内p-NF-κB/p65的表达(P<0.05),而且降低了COX-2和i NOS的水平(P<0.05,P<0.05)。6.体外实验结果显示:HF降低了脾MNCs培养上清液中炎性细胞因子IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-1β的浓度(P<0.05),并抑制了趋化因子MIP-1a(p<0.05)、MCP-1(P<0.01)、RANTES(P<0.01)的表达。结论:1.成功制备MOG35-33诱导的小鼠EAE模型;2.HF可延迟EAE小鼠模型的发病时间,改善CNS的髓鞘脱失,减轻临床症状的严重性;3.HF通过减少脾细胞中趋化因子的表达起到抑制炎性细胞向CNS浸润的作用;4.HF通过促进T细胞各亚群间的平衡而发挥免疫调节作用;5.HF通过下调致炎性细胞因子,促进巨噬细胞表型由M1向M2型转变,并抑制NF-κB的活化,下调i NOS和COX-2的表达起到缓解神经炎性反应的作用。第四部分羟基法舒地尔、盐酸法舒地尔治疗双环己酮草酰二腙诱导的脱髓鞘模型的疗效比较及作用机制研究目的:比较HF与盐酸法舒地尔对CPZ诱导的脱髓鞘小鼠模型的治疗效果,并探究其作用机制。方法:将雄性C57BL/6小鼠随机分为四组:正常组:接受常规饲料喂养6周;CPZ模型组:投喂含0.2%CPZ(w/w)的饲料6周;盐酸法舒地尔治疗组:投喂含0.2%CPZ(w/w)的饲料6周,于造模四周后给予腹腔注射盐酸法舒地尔(40mg/kg/d);HF治疗组:投喂含0.2%CPZ(w/w)的饲料6周,于造模四周后给予腹腔注射HF(40mg/kg/d)。正常组及CPZ模型组于四周后给予腹腔注射等量生理盐水。于实验结束时应用高架十字迷宫(EPM)和垂直木实验来检测小鼠的焦虑水平和运动能力。应用LFB和黑金染色(Black GoldⅡ,BGⅡ)对脑冰冻切片进行染色,以及Western blot法检测髓鞘碱性蛋白MBP的表达,免疫荧光染色法检测MBP的表达以及脑内成熟少突胶质细胞的数量来评估CPZ小鼠脑内髓鞘的脱失程度。分离脾脏并称取重量,制备脾MNCs,一部分MNCs通过流式细胞术检测T细胞亚群的分布、B细胞的比例;另一部分脾MNCs在含有MOG35-55(10μg/ml)的培养液中培养48小时。采用ELISA法检测各组小鼠脑内、血清以及脾MNCs培养上清液中细胞因子的浓度。应用ELISA法检测血清、脾MNCs培养上清液以及脑组织中的抗-MOG抗体,并应用Dot blot法和免疫荧光染色法检验其特异性。通过免疫荧光染色法,检测脑内抗-CD4、CD68、B220、Iba-1、i NOS,NF-κB和BDNF的表达。结果:1.与正常组相比,CPZ模型组小鼠表现出明显的行为学的改变,EPM检测结果显示,CPZ模型组小鼠进入闭合臂的次数明显增加(正常组为4.75±0.93,CPZ模型组为10.08±1.89,P<0.01)。同CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔组(6.58±1.04)及HF组(5.83±0.79)有效地减少了CPZ小鼠进入闭合臂的次数(P<0.05,P<0.05),但是盐酸法舒地尔组及HF组之间无显着差异。垂直木检测结果显示CPZ模型组小鼠自检测装置顶端至底部所需时间较正常组明显增加,正常组为(5.72±0.83)s,CPZ模型组为(15.29±1.24)s,P<0.01。与CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔组为(11.71±1.01)s,P<0.05,HF组为(10.14±1.10)s,P<0.05,有效地改善了CPZ小鼠的运动能力。但是盐酸法舒地尔组及HF组之间的差异未达到统计学意义。2.同正常组相比,CPZ模型组小鼠脑内胼胝体区LFB光密度、BGⅡ染色密度及MBP的表达均明显降低(P<0.001)。同CPZ模型组相比,HF组及盐酸法舒地尔组各染色法结果均显示小鼠脑内髓鞘的脱失明显减轻(P<0.01,P<0.001)。盐酸法舒地尔组BGⅡ染色法的光密度值高于HF组,该差异具有统计学意义(P<0.05)。3.CPZ模型组小鼠脑蛋白中MBP含量比正常组减少(P<0.001)。同CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔组及HF组脑蛋白中MBP的含量明显增加(P<0.001)。盐酸法舒地尔组MBP的表达高于HF组,差异显着,具有统计学意义,P<0.05。同正常组相比,CPZ模型组O4+少突胶质细胞数量明显减少(正常组为396.61±29.74,CPZ模型组94.23±9.23,P<0.001)。盐酸法舒地尔组(255.80±25.11)及HF组(258.24±26.37)较CPZ模型组相比,可有效增加O4+少突胶质细胞的数量(P<0.001)。盐酸法舒地尔组及HF组之间无显着差异。4.CPZ组小鼠的脾脏质量较正常组明显减小,正常组为(113.50±14.92)g,CPZ模型组为(57.13±2.65)g,P<0.001。盐酸法舒地尔组脾脏质量为(70.77±5.16)g,HF组为(65.83±3.04)g,同CPZ模型组相比,二者均可部分程度上改善CPZ所诱导的脾脏萎缩(P<0.05)。盐酸法舒地尔组及HF组之间差异不显着。5.通过ELISA法于CPZ小鼠的血清、脾MNCs培养上清液以及脑蛋白中均检测到抗-MOG抗体,同正常组相比,差异具有统计学意义(P<0.001,P<0.01,P<0.05),盐酸法舒地尔及HF可显着抑制CPZ小鼠血清、脾MNCs培养上清液以及脑蛋白中抗-MOG抗体的浓度(P<0.001,P<0.01),并且同盐酸法舒地尔相比,HF对抗-MOG抗体的抑制作用更强,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。应用Dot blot法检验不同稀释比例的血清中抗-MOG抗体的表达,CPZ模型组显着高于正常组,P<0.001,盐酸法舒地尔和HF表现出对该抗体的有效抑制,与CPZ模型组相比差异显着(P<0.001,P<0.01)。HF较盐酸法舒地尔的抑制作用更显着(P<0.05)。通过免疫荧光染色法验证了抗-MOG抗体可特异性地与少突胶质细胞结合。应用流式细胞术分析脾MNCs中B淋巴细胞亚群的比例,正常组、CPZ模型组、盐酸法舒地尔组及HF组分别为:(52.37±0.52)%,(62.17±0.13)%,(54.87±0.59)%,(52.97±0.23)%,与正常组相比,CPZ模型组的B220+B细胞比例增加(P<0.001)。而与CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔及HF可抑制这一改变(P<0.001),并且HF组同盐酸法舒地尔组相比,该比例更低,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.在CPZ模型小鼠脑内,可观察到CD4、CD68以及B220阳性的T淋巴细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞的表达,同正常组相比,差异显着(P<0.001)。盐酸法舒地尔及HF可显着抑制上述细胞向CPZ小鼠脑内的浸润(P<0.001)。7.同正常组相比,CPZ模型小鼠脑内胼胝体区以及纹状体区可见Iba-1+小胶质细胞的数量的显着增加(P<0.001);与CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔及HF可有效地减少CPZ小鼠脑内该细胞的数量(P<0.001);盐酸法舒地尔组及HF组之间无显着差异。应用双染技术,可见CPZ模型组小鼠脑内Iba-1+i NOS+以及Iba-1+NF-κB+的细胞数量较正常组明显增加(P<0.001),盐酸法舒地尔及HF可有效地减少CPZ小鼠脑内上述炎性细胞的数量,同CPZ模型组相比,差异显着,P<0.001,而盐酸法舒地尔及HF组之间无显着差异。盐酸法舒地尔及HF尚可抑制脑内炎性细胞因子IL-4(P<0.001)、IL-1β(P<0.001)和TNF-α的水平。8.HF促进了星形胶质细胞来源的BDNF的产生。结论:1.HF及盐酸法舒地尔可通过抑制抗-MOG特异性抗体的产生,抑制小胶质细胞介导的神经炎症、抑制外周炎性细胞浸润进而改善炎性微环境等作用来发挥对CPZ模型髓鞘的保护作用。2.HF还可促进神经营养因子的产生来促进髓鞘的再生。此外,同盐酸法舒地尔相比,HF表现出更强的抑制抗-MOG抗体的作用。结论1.HF的细胞毒性及其对细胞活性、细胞形态的影响呈浓度依赖型表现。2.HF的最大耐受剂量高于盐酸法舒地尔,具有较好的安全性。3.HF可改善EAE模型的临床症状,减轻脊髓中炎性细胞浸润,改善髓鞘脱失,并通过调节免疫、抑制神经炎性反应等途径发挥作用。4.HF及盐酸法舒地尔可通过抑制抗-MOG特异性抗体的产生,抑制小胶质细胞介导的神经炎症、改善炎性微环境,促进神经营养因子的产生等作用来发挥对CPZ模型的髓鞘保护以及促进髓鞘再生的作用。5.HF作为盐酸法舒地尔在体内的活性代谢产物,二者在治疗CPZ模型中疗效相近,但是同盐酸法舒地尔相比,HF具有对抗-MOG特异性抗体的抑制作用更强、毒性更低、不良反应更低的优势,具有很大的潜在应用价值。(本文来源于《山西医科大学》期刊2019-06-01）
张雨薇,刘宏,张博,王艳杰,黄树明[3]（2019）在《右归丸对中枢神经系统保护作用实验研究进展》一文中研究指出右归丸是传统具有益肾填精功效的经典方剂,该文对右归丸发挥神经保护作用的相关文献进行检索,从右归丸对行为学、神经元、神经再生、神经递质、突触可塑性及炎症反应的影响等诸多方面,对右归丸近年来开展的有关神经系统保护作用的实验研究概况展开综述,为拓展右归丸的临床应用及深入开展科学研究提供实验依据,同时也为丰富传统"益肾健脑"治则的科学内涵提供理论基础。(本文来源于《辽宁中医药大学学报》期刊2019年06期）
张明发,沈雅琴[4]（2018）在《氧化槐定碱和氧化槐果碱的中枢抑制和神经保护作用》一文中研究指出氧化槐定碱和氧化槐果碱具有中枢抑制和神经保护作用,其作用机制可能具有氧化苦参碱激活大麻素2型受体和上调电压门控钙离子N型通道表达,促进抑制性神经递质(γ-氨基丁酸、甘氨酸)合成和释放,下调γ-氨基丁酸转运体-1表达,使突触间隙γ-氨基丁酸浓度升高以及上调γ-氨基丁酸-A受体表达,从而增强γ-氨基丁酸能神经功能。γ-氨基丁酸能神经功能的增强可抑制兴奋性神经递质谷氨酸过度表达并下调天冬氨酸(NMDA)受体和蛋白激酶C-γ表达,使NMDA受体磷酸化减弱,降低NMDA受体对谷氨酸的兴奋性,从而下调电压门控钙离子L型通道的表达,抑制钙离子内流,阻滞钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ/cAMP反应元件结合蛋白(CaMKⅡ/CREB)通路,抑制炎症反应,产生中枢抑制和神经保护作用。综述氧化槐定碱和氧化槐果碱的中枢抑制和神经保护作用文献,并对其研究进展做了分析。(本文来源于《抗感染药学》期刊2018年09期）
张明发,沈雅琴[5]（2018）在《氧化苦参碱的中枢抑制和神经保护作用研究进展》一文中研究指出氧化苦参碱具有镇静、催眠、降体温、抗癫痫、改善认知功能、保护脑神经和外周神经作用。其作用机制可能是激活大麻素2型受体和上调电压门控钙离子N型通道表达,促进抑制性神经递质(γ-氨基丁酸、甘氨酸)合成与释放,下调γ-氨基丁酸转运体-1表达,使突触间隙γ-氨基丁酸浓度升高以及上调γ-氨基丁酸-A受体表达,从而增强γ-氨基丁酸能神经功能。γ-氨基丁酸能神经功能的增强可抑制兴奋性神经递质谷氨酸过度表达并下调N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和蛋白激酶Cγ表达,从而下调电压门控钙离子L型通道的表达,抑制钙离子内流,阻滞钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ/c-AMP反应元件结合蛋白通路,抑制炎症反应,产生中枢抑制和神经保护作用。(本文来源于《药物评价研究》期刊2018年10期）
黄倩倩,赵永烈,高俊峰,荆志伟,张娜[6]（2018）在《地黄饮子对AD大鼠中枢神经线粒体结构及功能的保护作用》一文中研究指出目的:以侧脑室注射β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)致痴呆大鼠为阿尔茨海默病(AD)模型,探讨地黄饮子对AD大鼠中枢神经线粒体结构功能损伤的保护机制。方法:120只SD大鼠随机分为假手术组,模型组,阳性药(安理申,0.5 mg·kg~(-1))组,地黄饮子高、中、低剂量组(3,1.5,0.75 g·kg~(-1))。除假手术组外,其他大鼠均在左侧脑室注射老化的Aβ1-42建立AD大鼠模型。经灌胃给予地黄饮子30 d后,采用Morris水迷宫和跳台实验检测地黄饮子对AD大鼠学习记忆能力的影响,高效液相色谱法检测AD大鼠脑组织中叁磷酸腺苷(ATP),二磷酸腺苷(ADP),单磷酸腺苷(AMP),磷酸肌酸(PCr),并计算能荷(EC)水平,光吸收法检测线粒体中丙酮酸脱氢酶(PDH)和α-酮戊二酸脱氢酶(KGDH)活性、线粒体肿胀度、膜电位等。结果:地黄饮子可以显着改善AD大鼠学习记忆能力,与模型组比较,地黄饮子升高大鼠脑组织ATP,ADP,PCr及EC水平(P<0.05,P<0.01),升高叁羧酸循环关键酶PDH和KGDH活性(P<0.05,P<0.01),降低线粒体肿胀程度(P<0.05,P<0.01),升高线粒体膜电位(P<0.05,P<0.01)。结论:地黄饮子药能通过保护线粒体结构功能,改善能量代谢,提高AD大鼠学习记忆能力。(本文来源于《中国实验方剂学杂志》期刊2018年21期）
张明发,沈雅琴[7]（2018）在《还原型苦参碱类生物碱的中枢抑制和神经保护作用研究进展》一文中研究指出还原型苦参碱类生物碱(包括苦参碱、槐定碱、槐果碱、拉马宁碱、槐胺碱、13α-羟基苦参碱等)具有中枢抑制和神经保护作用。其作用机制可能与以下作用密切相关:苦参碱类生物碱激活大麻素2型受体和上调电压门控钙离子N型通道表达,促进抑制性神经递质(γ-氨基丁酸、甘氨酸)合成和释放,下调γ-氨基丁酸转运体-1表达,使突触间隙γ-氨基丁酸浓度升高以及上调γ-氨基丁酸-A受体表达,从而增强γ-氨基丁酸能神经功能,产生中枢抑制作用;还可能通过抗氧化以及抑制把关受体-4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)通路和激活蛋白激酶A/c AMP反应元件结合蛋白(PKA/CREB)通路,抑制炎性因子表达,改善神经组织的微炎症状态,进而产生神经保护作用。(本文来源于《药物评价研究》期刊2018年08期）
朱韵韵,郭原,周亚杰,冯鹏,冯敏[8]（2018）在《银杏叶提取物保护中枢神经系统作用机制及临床应用研究进展》一文中研究指出银杏叶提取物为银杏科植物银杏的干燥叶经加工制成的提取物,国内外的大量研究表明,其在保护中枢神经系统中有多环节、多靶点共同作用,并且不良反应小、安全性好的优势,应用前景良好(本文来源于《世界最新医学信息文摘》期刊2018年50期）
许琳[9]（2018）在《MK801和牛磺酸对1-溴丙烷中枢神经毒性的保护作用及机制研究》一文中研究指出1研究目的1-溴丙烷(1-Bromopopane,1-BP),又称正丙基溴,溴代正丙烷或溴正丙烷,无色液体,有刺激性气味,易挥发,不易燃,在大气中半衰期短,不破坏大气臭氧层,是一种工业用有机溶剂。根据蒙特利尔草案,全球已经逐步停止了臭氧层消耗剂含氯氟烃(hydro chlorofluorocarbons,HCFCs)的生产和消耗。1-BP被USEPA新替代物政策项目选为HCFCs的替代物,主要用作精密仪器清洗剂、喷雾粘合剂和冷浴去脂剂。然而,随着1-BP使用量的增加,对其毒性的研究报道也越来越多,其对接触人群的潜在危害不容忽视。近年来的报道显示1-BP有多种毒性,包括肝脏毒性、神经毒性、发育毒性,致癌等,其中中枢神经毒性是1-BP最早出现的也是最复杂的毒性,但目前1-BP中枢神经毒性机制的研究还未完全阐明,临床上亦缺乏特效治疗药物。NMDA受体是谷氨酸的离子型受体,与学习记忆和突触的可塑性密切相关。MK-801是NMDA受体的非竞争性拮抗剂,有研究显MK-801能够阻止因NMDA激活造成的Ca2+超载,以及其他的一系列变化所带来的神经元损伤。先前研究观察到1-BP能引起海马DG区兴奋性增高,研究者推测是因NMDA受体过度激活所致。另外研究显示,慢性吸入1-BP激活大脑MAPK通路,推测也可能与NMDA受体激活有关。但是NMDA受体与1-BP中枢神经毒性之间确切的关系尚未见文献报道。因此,本研究第一部分实验采用MK80作为干预剂,观察N-MDA受体在1-BP中枢神经毒性中的作用;并根据第一部分实验中1-BP染毒后动物大脑中的神经递质含量的分析发现1-BP染毒组大鼠大脑皮层和海马中牛磺酸显着降低,因此第二部分实验选取了牛磺酸作为干预,从氧化应激,凋亡等方面研究补充牛磺酸是否具有保护作用及其机制,为1-BP的神经毒性的预防以及治疗提供理论参考数据。2研究方法1.MK801对1-BP致大鼠中枢神经系统毒性的保护作用及机制1.1动物处理48只雄性SPF级Wistar大鼠按照体重随机分为4组(n=12),分别是空白对照组、1-BP染毒组、MK-801+1-BP干预组、MK-801单独对照组。动物适应性喂养5天后开始给药,其中1-BP经玉米油溶解稀释,经口染毒,剂量为800mg/kg.bw;MK-801溶于生理盐水,在1-BP染毒前一个小时腹腔注射给药,剂量为0.1mg/kg.bw,空白对照组给予等体积的玉米油和腹腔注射等体积的生理盐水,MK801对照组给予0.1mg/kg.bw MK801腹腔注射和等体积玉米油灌胃,连续实验14天。1.2水迷宫实验实验第14天到第20天,每组所有动物分别进行Morris水迷宫实验1.3组织病理水迷宫实验结束后,每组选取4只大鼠用10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛经心脏灌注,迅速剥离大脑,放于4%多聚甲醛中进行后固定48小时,转移至30%蔗糖溶液中沉底后,在冰冻切片机上制备厚度为40um的脑片,分别进行硫堇染色,NeuN染色和Iba-1染色,观察神经元的形态和小胶质细胞形态。1.4高效液相色谱法测定大鼠大脑内氨基酸类神经递质的含量,准确称取各组大鼠大脑皮层和海马(n=5),按照质量:体积=1:9,用50%甲醇的水溶液匀浆,12000g低温离心10min后取上清,将上清再次12000g离心10min后取上清。配置L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸、牛磺酸的标准溶液。用移液枪分别吸取混合标准溶液/待测样品匀浆液150ul,0.5mol/LNaHCO3溶液100ul,0.5%NFB-D(2,4-二硝基氟苯)溶液50ul于1.5ml的EP管内,混匀,65℃水浴中暗反应55min,精确控制水温和反应时间。反应结束后取出,冷却至室温,用0.22um的水系滤膜过滤反应液,置于液相进样瓶中待用,设置仪器参数进行测定。1.5谷氨酰胺含量用谷氨酰胺试剂盒进行测定。1.6 Western Blotting检测大鼠大脑NMDA受体亚基以及炎症相关蛋白的表达。水迷宫实验结束后,处死大鼠,快速分离大鼠大脑皮层和海马,用RIPA裂解液制备组织匀浆,采用Western Blotting检测大鼠皮层和海马中NMDA受体亚基NR2A,NR2B的表达,以及炎症相关蛋白NLRP3,IL-1β,caspase-1的表达。2.牛磺酸对1-BP致大鼠中枢神经毒性的保护作用及机制2.1动物处理SPF级成年雄性Wistar大鼠60只,适应性喂养5天后,按照体重随机分成4组(n=12),分别是空白对照组、1-BP染毒组、牛磺酸100mg/kg+1-BP组、牛磺酸200mg/kg+1-BP组、牛磺酸对照组。1-BP用玉米油溶解,剂量为800mg/kg,经口染毒;牛磺酸用双蒸水溶解,在1-BP染毒前一个小时经口分别给予牛磺酸1OOmg/kg+1-BP组、牛磺酸200mg/kg+1-BP组和牛磺酸对照组动物,空白对照组给予等体积的玉米油,牛磺酸对照组给予200mg/kg牛磺酸,连续14d。2.2水迷宫实验实验第14d到第20天,每组所有动物分别进行Morris水迷宫实验。2.3各组大鼠大脑MDA水平的检测按照质量:体积=1:9用PBS匀浆脑组织,低温1600g离心10分钟取上清,用MDA试剂盒进行检测。2.4高效液相色谱测定大鼠大脑皮层和海马中牛磺酸的含量,方法同1.42.5 Western Blotting水迷宫实验结束后,处死大鼠,分离大鼠大脑皮层和海马,用配置好的RIPA裂解液制备组织匀浆,采用Western Blotting检测大鼠皮层和海马中线粒体复合蛋白 I-V、ASK1、P-ASK1、P38MAPK、P-P38MAPK、Bc1-2、BAX、caspase-3以及 cleaved-caspase3 的表达。3研究结果3.1 MK801对1-BP大鼠中枢神经系统毒性的保护作用及机制3.1.1MK-801对1-BP致大鼠学习记忆能力损伤的影响空间探索实验中,随时间增加,各组大鼠逃避潜伏期均呈逐渐缩短趋势。与对照组相比,1-BP染毒组逃避潜伏期延长,游泳总距离明显增加,差异均具有统计学意义(尸<0.05);MK-801干预组与染毒组相比,逃避潜伏期和游泳总路程减少,差异有统计学意义(P<0.05)。定位航行实验中,与对照组相比,1-BP染毒组穿越平台次数明显降低(尸<0.01),而MK-801干预组与对照相比没有差异(尸>0.05)。实验过程中,各组大鼠的游泳速度无统计学差异(尸>0.05),可排除运动能力受损对实验结果的影响。3.1.2 MK801对1-BP染毒大鼠大脑皮层和海马组织、病理形态的影响硫堇染色中,1-BP染毒组大脑皮层中的神经细胞染色变浅,可观察到空泡形态细胞,海马CA1区以及CA3区细胞边界不清,形态皱缩,给予MK-801干预能明显改善神经细胞的形态。NeuN染色神经细胞计数结果显示,1-BP染毒组大鼠海马CA1区和CA3区NeuN阳性细胞数目与对照组相比,分别减少了 24.9%和31.7%(P<0.01)。而MK801干预组的CA1区和CA3区细胞数目与染毒组相比上升(尸<0.01)。3.1.3 MK801对1-BP染毒大脑中氨基酸类神经递质含量的影响1-BP染毒组与对照组相比较,天门冬氨酸在皮层和海马中均升高(P<0.01),牛磺酸在海马和皮层中均降低(P<0.01),甘氨酸在海马和皮层中均升高(尸<0.01),谷氨酸没有明显变化,GABA在皮层和海马中均降低,但只在海马中有统计学意义(尸<0.05)。给予MK-801干预后,海马和皮层中甘氨酸以及天门冬氨酸的量与1-BP染毒组相比,明显降低,差异具有统计学意义(尸<0.01)。3.1.4 1-BP染毒对大鼠大脑中谷氨酰胺的影响大脑皮层中,1-BP染毒组与对照组相比,谷氨酰胺含量上升了 20.1%(尸<0.05),而MK801干预组与1-BP组相比,谷氨酰胺降低了 16.3%(尸<0.05);海马中,1-BP染毒组与对照组相比,谷氨酰胺含量上升了 27.3%(P<0.01),而MK801干预组与1-BP组相比,谷氨酰胺降低了 18.2%(尸<0.05)。3.1.5 MK801对1-BP染毒大鼠大脑NMDA受体亚基表达变化的影响1-BP染毒组与对照组相比,NR2A和NR2B在大脑皮层和海马中均降低(尸<0.01)。给予MK801干预后,与1-BP组相比,NR2A和NR2B均升高(P<0.01)。3.1.6 MK801对1-BP染毒大鼠大脑炎性反应的影响小胶质细胞免疫组化染色显示,1-BP染毒组小胶质细胞胞体增大,分支增多,呈现“阿米巴”样改变。各组小胶质细胞计数无统计学差异(尸>0.05);对染色细胞进行积分光密度分析,1-BP组与对照组相比,大脑皮层、CA1和CA3区中小胶质细胞染色的积分光密度分别增加了 55.2%、52.7%和59..3%(P<0.01)。给予MK801干预后,与1-BP组相比,小胶质细胞染色的积分光密度显着降低(尸<0.01)。此外,采用蛋白电泳检测了炎性相关蛋白NLRP-3、IL-1β、caspase-1的表达,1-BP组与对照组相比,大脑皮层和海马中NLRP-3、IL-1β、活化的caspase-1表达均明显升高(尸<0.01)。给予MK801干预后,与1-BP组相比,NLRP-3、IL-1β、活化的 caspase-1 表达降低(P<0.01)。3.2牛磺酸对1-BP致大鼠中枢神经毒性的保护作用及机制3.2.1牛磺酸对1-BP染毒引起大鼠的学习记忆损伤的影响空间探索实验中,随时间增加各组大鼠逃避潜伏期均呈逐渐缩短趋势。与对照组相比,1-BP染毒组逃避潜伏期延长,游泳总距离明显增加,差异均具有统计学意义(尸<0.01)。定位航行实验中,与对照组相比,1-BP染毒组穿越平台次数明显降低(尸<0.01),而牛磺酸干预组与1-BP染毒组相比,穿越平台次数增加(尸<0.01),说明1-BP损伤了大鼠的空间记忆能力,而牛磺酸能够明显改善1-BP导致的大鼠空间学习记忆损伤。实验中,各组大鼠的游泳速度无差异,排除运动能力损伤对游泳的影响。3.2.2牛磺酸对1-BP染毒大鼠大脑组织病理形态的影响大鼠大脑皮层的神经元硫堇染色中,1-BP染毒组的神经细胞染色变浅,有空泡形态的细胞。海马CA1区和CA3区染色中,1-BP染毒组细胞边界不清,形态皱缩,给予牛磺酸干预后动物神经细胞形态趋于正常。NeuN染色及细胞计数表明,1-BP染毒组大鼠与对照组相比,皮层神经细胞计数降低了 37.5%(P<0.01),而牛磺酸干预低剂量组和高剂量组与1-BP染毒组相比,细胞计数分别升高了33.6%,37.1%(P<0.01);1-BP染毒组大鼠与对照组相比,海马CA1和CA3区神经细胞计数分别降低了 30.2%,33.1%(P<0.01),而牛磺酸干预低剂量组和高剂量组与1-BP染毒组相比,CA1细胞计数分别升高了 24.5%,27.7%,CA3分别升高了 29.3%,32.4%(尸<0.01)。3.2.3各组大鼠大脑MDA的含量大脑皮层中,1-BP染毒组MDA含量与对照组相比,升高了 24.8%(P<0.05);与1-BP染毒组相比,牛磺酸低剂量组和高剂量组MDA含量分别降低了 21.0%,21.3%(P<0.05)。海马中,1-BP染毒组MDA含量与对照组相比,升高了 20.1%(P<0.05);与1-BP染毒组相比,牛磺酸低剂量组和高剂量组MDA含量分别降低了 8.3%,32.4%(P<0.05)。3.2.4高效液相色谱法检测各组大鼠皮层和海马牛磺酸的含量皮层和海马中,1-BP染毒组与对照组相比牛磺酸含量分别降低了 43.1%,40.1%(P<0.01)。给予牛磺酸干预后,大脑皮层和海马中的牛磺酸含均升高,且有剂量反应关系。低剂量磺酸干预组大鼠大脑皮层和海马中牛磺酸含量较1-BP染毒组分别升高了 42.5%,50.1%(P<0.01);高剂量牛磺酸干预组大脑皮层和海马中牛磺酸含量较1-BP组分别升高了 57.3%,57.6%(P<0.01)。3.2.5牛磺酸对大脑中线粒体复合蛋白表达的影响大鼠大脑皮层中,1-BP染毒组粒体复合体蛋白I-V表达与对照组相比均明显下降,其中I-IV蛋白表达的差异有统计学意义(P<0.05),蛋白V的表达没有统计学意义(P>0.05),同时给予不同剂量的牛磺酸时,线粒体复合体蛋白I-IV的表达均有不同程度的恢复,各剂量组差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,1-BP染毒组海马中线粒体I-V均有不同程度的下降,其中线粒体蛋白I和IV与对照组相比有统计学意义(P<0.05),同样给予牛磺酸时,线粒体复合蛋白有不同程度的恢复。3.2.6牛磺酸对ASK1/P38MAPK蛋白表达的影响在大脑皮层和海马中,1-BP染毒组与对照组相比,P-ASK1分别升高了 51.6%,40.9%(P0.01),P-P38 分别升高了 46.9%,37.5%(P<0.01)。给予牛磺酸干预后,降低了大脑皮层和海马中P-ASK1和P-P38的表达,差异具有统计学意义(P<0.01)。3.2.7牛磺酸对凋亡相关蛋白的影响大脑皮层中,1-BP染毒组与对照组相比,Bc1-2降低了 33.3%(P<0.01),BAX 增加了 21.1%(P<0.05),BAX/Bc1-2 比值升高了 48.5%(P<0.01)。在海马中,1-BP染毒组与对照组相比,Bc1-2降低了 33.9%(P<0.01),BAX增加了11.4%,BAX/Bc1-2比值升高了 38.9%(P<0.01)。给予牛磺酸干预后,与染毒组相比,大脑皮层和海马中Bc1-2升高,BAX降低(尸<0.05)。大脑皮层和海马中,1-BP染毒组与对照组相比,caspase-3降低,但无统计学差异,活化的caspase-3分别升高了 55.0%,25%(P<0.01);cleavead-caspase-3/caspase3 分别升高了 57.3%,28.2%(P<0.01)。给予牛磺酸干预后,与染毒组相比,大脑皮层和海马中活化的caspase-3均降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。4研究结论1.1-BP染毒导致大鼠脑内兴奋性氨基酸升高,抑制性氨基酸降低,引起大脑兴奋效应,NMDA受体敏感性增加,另一方面,NMDA受体NR2A和NR2B功能亚基表达下调,引起学习记忆功能损伤。1-BP染毒引起大脑皮层和海马小胶质细胞的活化,炎症因子表达增加,给予MK801干预后,改善了大鼠学习记忆功能,纠正NR2A和NR2B功能亚基表达异常,明显减轻小胶质的活化以及炎症因子的表达。2.牛磺酸可显着改善大鼠大脑中牛磺酸的降低,拮抗1-BP染毒引起的中枢神经系统氧化损伤,以及通过ASK/P38通路改善1-BP引起的大鼠大脑细胞凋亡,从而显着改善1-BP染毒引起的认知损伤。(本文来源于《山东大学》期刊2018-04-20）
刘洋[10]（2018）在《外周免疫耐受在中枢神经系统炎症介导的多巴胺能神经元损伤中的神经保护作用机制研究》一文中研究指出目的:帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的神经系统变性疾病,其病理特征是黑质区多巴胺能神经元的大量缺失。这种严重威胁老年人的健康、影响其生活质量的疾病的发病率呈现逐年上升的趋势。PD是多因素疾病,其病因和发病机制仍不甚清晰,但是,积累的临床和实验证据表明,中枢神经系统的炎症在PD的发病和疾病进程中均起着关键作用。而小胶质细胞又在中枢炎症中扮演着重要角色,如释放各种炎症介质等,促进了神经系统变性疾病的发生和发展。虽然外周与中枢之间存在着血脑屏障(Blood brain barrier,BBB),但机体仍旧是一个不可分割的有机整体,因此,中枢神经系统的免疫状态将受到外周免疫状态的深刻影响。众所周知,外周炎症能够引起中枢的炎症,并与神经系统变性疾病的发病和进展密切相关。一个经典的例子是外周大剂量注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)后会造成脑内黑质区多巴胺能神经元的损伤。近来的几项流行病学研究证实,流感过后PD的发病率显着增加;另一方面,长期使用非甾体抗炎药会对外周免疫造成抑制,使PD的发病率降低了约50%。这些证据都强有力地说明了外周炎症对中枢的深刻影响。小胶质细胞是中枢神经系统胶质细胞中最重要的组成成分,作为中枢的固有免疫细胞,在调节脑内微环境中起着至关重要的作用。在静止状态下,小胶质细胞与神经元和平相处。一旦激活后,小胶质细胞可以通过改变其形态、增殖并上调表面抗原、分泌促炎因子和神经介质,如一氧化氮、前列腺素E2、活性氧等来启动炎症反应,并与其他神经胶质细胞、神经元等产生相互作用。现有的一些研究表明,由过度激活的小胶质细胞引发的中枢炎症可能会破坏脑内的微环境,继而威胁到神经元的存活,这其中也必然包括多巴胺能神经元。外周血单核巨噬细胞(Peripheral blood mononuclear,PBM)作为整个免疫系统的启动者和组织者,在机体的外周免疫活动中扮演着多重角色。我们团队最近进行的一项研究是在外周炎症之前耗竭单核细胞,这使得本应该发生的炎症得以削弱。这一研究说明单核细胞在外周炎症的形成和发展中起着至关重要的作用。随着时间的推移,越来越多的研究着眼于单核细胞在神经系统疾病中扮演的角色。一方面,脑内的小胶质细胞和外周血单核细胞同属单核巨噬细胞系统,具有相似的起源、功能及受体表达。正因为如此,很多学者认为单核细胞在外周的行为能够反应脑内小胶质细胞的免疫状态。另一方面,已有的证据表明单核细胞能够进入脑内演变为小胶质细胞,或者形成一群特殊的中枢神经系统巨噬细胞群。这些都表明单核细胞是外周免疫影响中枢免疫的重要媒介,其在外周的免疫状态对脑内炎症的转归意义非凡。炎症反应最初目的是保护机体,但凡事过犹不及。因此及时限制、下调免疫反应极为重要。实际上机体在进化过程中形成了一整套严格限制和下调免疫反应的机制,其中一个重要的环节即是免疫耐受的形成。免疫耐受是指免疫系统在受到首次刺激激活后,继续受到刺激将出现不应期,表现为促炎因子分泌下降,抗炎因子分泌上升,T细胞激活受到抑制等。免疫耐受是机体面对持续抗原威胁或连续打击的一种保护机制,它避免了不必要损伤的发生。单核细胞的内毒素耐受是由低剂量LPS诱导产生的,它被认为是免疫耐受的重要组成成分。Rosenzweig等人的实验发现外周低剂量LPS预处理对缺血脑组织起到了显着的保护作用,使梗塞面积下降了40%,此外低剂量LPS预处理的神经保护作用还被证实于脑创伤、低温循环阻滞脑损伤等神经损伤中。外周炎症会导致并加剧脑内炎症,随后,脑内炎症诱发的小胶质细胞异常激活会对多巴胺能神经元造成损伤,导致PD的发生。那么是否可以通过及时下调外周免疫反应来起到神经保护作用,现有研究对这方面涉猎的很少。考虑到低剂量LPS能够诱导单核巨噬细胞建立免疫耐受,而单核细胞是外周与中枢免疫连接的重要媒介,据此我们推测:低剂量LPS诱导了外周单核巨噬细胞免疫耐受,使其免疫活动下调,继而抑制小胶质细胞活化,下调脑内炎症,使更多的神经元免于无辜的炎症损伤,从而对神经元起到神经保护作用。研究方法:为了探讨低剂量LPS重复腹腔注射是否可以诱导大鼠外周血单核细胞免疫耐受的建立,我们给予大鼠0.3mg/kg LPS连续4天腹腔注射,在第5天时以淋巴细胞分离液及细胞贴壁法分离培养大鼠外周血PBM,并给予100ng/ml LPS再刺激。随后采用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测培养PBM细胞上清中促炎因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的含量,采用蛋白质印迹(Western blotting,WB)检测培养PBM细胞表面抗原Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)的表达;同时,为了验证诱导大鼠外周血单核细胞免疫耐受形成的LPS剂量是否会在脑内黑质区产生炎症及造成多巴胺能神经元损伤,我们分别于外周处理后的第1d、7d、14d、28d,采用ELISA检测脑组织中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量,采用WB检测脑组织中小胶质细胞标志抗原小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白抗体-1(Ionized calcium binding adapter molecule-1,Iba-1)的表达,采用免疫组化染色及细胞计数检测脑内黑质区多巴胺能神经元的存活状态。为了探讨纹状体内注射LPS是否可以模拟由神经炎症介导的PD模型,我们给予大鼠纹状体内立体定向注射15μg LPS,分别于颅内注射后的第1d、7d、14d、28d,采用免疫组化染色及细胞计数检测脑内黑质区多巴胺能神经元的存活状态,采用安非他明诱导的旋转实验评估大鼠的行为学损伤状况。为了探讨外周免疫耐受预处理是否会对后续的神经系统炎症起到缓解作用,并对多巴胺能神经元产生神经保护作用,我们预先给予大鼠0.3mg/kg LPS连续4天腹腔注射诱导其形成免疫耐受,随后给予大鼠纹状体内立体定向注射15μg LPS以模拟PD模型。分别于颅内注射后的第1d、7d、14d、28d,采用ELISA检测脑组织中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量,抑炎因子白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)的含量,并采用实时定量反转录聚合酶链反应(Quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction,qRT-PCR)测定TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平,以评价脑内黑质区炎症情况;采用免疫组化染色及免疫荧光染色测定小胶质细胞抗原Iba-1、ED-1的表达,并采用qRT-PCR测定ED-1的mRNA表达水平,以评价脑内黑质区小胶质细胞的激活情况;采用免疫组化染色及细胞计数检测脑内黑质区多巴胺能神经元的存活状态,采用安非他明诱导的旋转实验评估大鼠的行为学损伤状况。结果:1.低剂量LPS重复腹腔注射可以诱导大鼠外周血单核细胞免疫耐受的建立。2.诱导大鼠外周血单核细胞免疫耐受形成的LPS剂量不会引起脑黑质内的炎症。3.诱导大鼠外周血单核细胞免疫耐受形成的LPS剂量不会引起脑黑质内的多巴胺能神经元损伤。4.LPS纹状体内注射可以诱导脑内黑质区多巴胺能神经元损伤。5.LPS纹状体内注射可以导致大鼠行为学发生变化。6.外周免疫耐受预处理抑制纹状体内注射LPS介导的脑内黑质区促炎因子的分泌。7.外周免疫耐受预处理不影响纹状体内注射LPS介导的脑内黑质区抑炎因子的分泌。8.外周免疫耐受预处理抑制纹状体内注射LPS介导的脑内黑质区小胶质细胞的激活。9.外周免疫耐受预处理削弱纹状体内注射LPS介导的脑内黑质区多巴胺能神经元损伤。10.外周免疫耐受预处理改善纹状体内注射LPS介导的大鼠行为学损害。结论:我们的研究结果表明,连续低剂量LPS腹腔注射可以诱导外周血单核细胞免疫耐受的建立。纹状体内LPS立体定向注射可以很好地模拟中枢炎症诱导PD发生的大鼠模型建立。外周免疫耐受是调节PBM免疫活性的重要机制。我们的研究结果亦强烈地表明外周免疫耐受预处理能够缓解后续的神经系统炎症,并在神经系统炎症介导的神经毒性中产生神经保护作用。这将为神经系统变性疾病提供新的治疗方法。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-02-01）
中枢保护作用论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
Rho/ROCK信号通路参与多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomylitis,EAE)的病理过程,在免疫细胞活化、炎性细胞经破坏的血-脑屏障(blood brain barrier,BBB)向中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)迁移、髓鞘脱失、轴索损害以及胶质细胞反应等方面扮演着重要的角色。盐酸法舒地尔(Fasudil)是目前临床用于治疗蛛网膜下腔出血后血管痉挛的Rho激酶(Rho kinase,ROCK)抑制剂。有研究表明盐酸法舒地尔具有改善EAE免疫炎性微环境、保护髓鞘等作用,且具备促进神经突触再生的能力和内源性神经干细胞动员的潜能。但是,盐酸法舒地尔同时存在着迅速明显的血管扩张作用、长期使用安全窗较小且给药途径单一、口服生物利用度差、半衰期短等局限性。因此寻求和研发更有效、更安全且副作用更小的新型ROCK抑制剂来治疗神经系统慢性病的任务就显得越来越迫切。羟基法舒地尔(Hydroxyfasudil,HF)是盐酸法舒地尔在体内的活性代谢产物,活性比盐酸法舒地尔强,半衰期更长,并且作为ROCK抑制剂,HF具有更高的选择性。动物实验表明其在恶性肿瘤、肺动脉高压、心脑血管痉挛、心肌缺血、缺血性脑损伤等疾病的预防和治疗中具有潜在价值。因此,在本研究中首先于细胞水平检验HF的细胞毒性、对神经元活性以及形态的影响;其次,通过小鼠急性毒性实验,验证其安全性并了解HF的最大耐受剂量(Maximum Tolerance dose,MTD);继之,在EAE模型验证HF的临床有效性;最后,比较HF以及盐酸法舒地尔在双环己酮草酰二腙(Cuprizone,CPZ)诱导的CNS脱髓鞘模型的疗效,并研究HF对髓鞘的保护以及促进髓鞘再生的作用,探讨其可能的作用机制。第一部分羟基法舒地尔的细胞毒性及其对SHSY-5Y神经元细胞活性、形态的影响目的:观察并比较HF及盐酸法舒地尔的细胞毒性及其对SHSY-5Y神经元细胞活性和形态的影响。方法:SHSY-5Y(人源多巴胺神经细胞系)经标准程序复苏后进行常规培养和传代。待生长状态和细胞密度合适时进行药物干预实验,将神经元与不同浓度的HF及盐酸法舒地尔(3μg,15μg,75μg,200μg/ml)共同培养24h。神经元的活性采用MTT比色法检测。对神经元的细胞毒性测定采用LDH酶标法。SHSY-5Y神经元与HF、盐酸法舒地尔共培养24h后,在显微镜下观察培养状态中的神经元的形态。结果:1.同PBS对照组相比,相对低浓度(3μg/ml,15μg/ml)的HF及盐酸法舒地尔的细胞毒性不显着,随着药物浓度的增加,对SHSY-5Y神经元的毒性增加,特别是当浓度达到200μg/ml时,与PBS组相比,P<0.05,差异具有统计学意义。HF与盐酸法舒地尔组间无显着差异。2.同PBS对照组相比,相对低浓度(3μg/ml,15μg/ml)的HF及盐酸法舒地尔并不影响细胞活性,但是当浓度增加至75μg/ml,200μg/ml时SHSY-5Y神经元活性降低,P<0.05,差异具有统计学意义。HF与盐酸法舒地尔组间无显着差异。3.相对低浓度(3μg/ml)的HF和盐酸法舒地尔未明显影响SHSY-5Y神经元的形态,当浓度增至15μg/ml时可有效促进神经突的形成,而当浓度增至75μg/ml时可见神经突受损。结论:HF在体外实验中表现出较好的安全性,与盐酸法舒地尔相比无显着差异。第二部分羟基法舒地尔对小鼠的急性毒性实验目的:观察HF对小鼠的急性毒性,评价药物的安全性。方法:第一部分:将36只C57BL/6小鼠(8-10周龄,20-22g)随机分为6组(雌雄各半),即盐酸法舒地尔-80、100、125mg/kg和HF-80、100、125mg/kg。将HF和盐酸法舒地尔溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,使用前用0.1%冰醋酸稀释,腹腔注射。DMSO的最终浓度为10%(v/v)。观察小鼠的毒性反应,包括皮毛、进食情况、大小便情况、自主运动情况及不自主运动症状、死亡情况等。第二部分:为了排除酸性溶剂对实验结果的影响,重复100mg/kg和125mg/kg两个浓度组的实验。将16只C57BL/6小鼠随机分成4组(雌雄各半),使用0.9%Na Cl溶解盐酸法舒地尔,HF溶解方法同前。观察小鼠的毒性反应,包括皮毛、进食情况、大小便情况、自主运动情况及不自主运动症状、死亡情况等。结果:1.第一部分实验结果显示:随着药物浓度的增加,小鼠的自主运动逐渐减少,呼吸频率增加,双后肢紧贴地面,无法站立。与HF组相比,相同浓度的盐酸法舒地尔组小鼠自主运动较少,不自主运动增加,抽搐发生率和死亡率较高。盐酸法舒地尔-125mg/kg组小鼠在药物注射2分钟后出现惊厥,随后全身僵硬,然后死亡;相同浓度的HF组小鼠仅表现为自主运动减少,并且没有出现抽搐和死亡现象。2.第二部分结果显示:盐酸法舒地尔-125mg/kg(0.9%Na Cl溶解)组中的两只小鼠在注射药物5分钟后出现惊厥,呼吸速率加快并于30分钟后死亡。其余两只小鼠表现出较少的自主运动,双后肢不能站立。HF-125mg/kg(DMSO+0.1%冰醋酸溶解)组小鼠除了自主活动轻度减少以外,并没有出现抽搐和死亡现象。结论:HF的最大耐受剂量大于125mg/kg,说明HF较盐酸法舒地尔毒性更低,安全性更高。第叁部分羟基法舒地尔对实验性自身免疫性脑脊髓炎的防治作用及机制研究目的:建立髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)35-55诱导的EAE小鼠模型,观察HF在EAE模型中的治疗效果,并探讨其可能的分子机制。方法:EAE模型由MOG35-55多肽免疫雌性C57BL/6小鼠制备。随机分为EAE组、HF治疗组。HF于免疫后第3天开始腹腔注射(40mg/kg/d)直至第28天。期间观察小鼠行为学变化。免疫后第28天,取脊髓制备冰冻切片行组织学检测:苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色、卢卡斯快蓝(Luxol Fast Blue,LFB)染色。提取脊髓组织蛋白,通过Western blot法检测NF-κB、COX-2、i NOS的表达。制备脾单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs),应用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群;收集MNCs培养上清液,应用ELISA法检测细胞因子;应用Real-time PCR法检测脾MNCs中趋化因子的表达,以及脊髓中M1、M2型巨噬细胞标志物指标。在另一项实验中,建立EAE模型,于免疫后第9天,取脾脏制备MNCs,应用MOG刺激,与HF共培养,检测脾MNCs培养上清液中炎性细胞因子的浓度。结果:1.行为学变化:免疫后第12天EAE组小鼠陆续出现运动功能障碍,平均发病时间为免疫后(16.38±4.98)天,且随时间延长,临床症状加重,评分逐渐增高,EAE组小鼠的临床症状的平均最高分值为(3.84±1.09)分,HF治疗组小鼠则未出现可测的运动障碍表现,两组之间差异显着(P<0.01,P<0.001)。2.组织学检测:脊髓冰冻切片HE染色显示:EAE小鼠脊髓白质内大量炎性细胞密集环绕于小血管周围,呈血管“袖套样”改变。EAE组炎性细胞浸润面积占白质总面积的(1.15±0.09)%,HF治疗组为(0.64±0.18)%,炎性细胞的浸润明显减少,两组比较有统计学意义(P<0.01)。LFB染色可见EAE小鼠脊髓白质内片状髓鞘脱失区。EAE组髓鞘脱失区占白质总面积的(1.20±0.16)%,HF治疗组为(0.37±0.02)%,显着减少了脊髓白质内髓鞘的脱失(P<0.01)。3.流式细胞术检测HF对EAE小鼠脾MNCs中T淋巴细胞亚群变化的影响。结果显示,与EAE组相比,HF可上调CD4+CD25+T细胞的比例(P<0.05);下调CD4+IFN-γ+(P<0.05)和CD4+IL-17+T(P<0.05)细胞的比例。同时,与EAE组相比,HF可抑制脾MNCs培养上清液中IFN-γ和IL-17的表达(P<0.05)。4.Real-time PCR检测巨噬细胞标志物的表达,结果显示,与EAE组相比,HF增加了M2型巨噬细胞标志物Arg-1(P<0.05)、IL-4(P<0.01)、TGF-β(P<0.01)的表达,并抑制M1型巨噬细胞标志物i NOS(P<0.001)、CD68(P<0.001)和TNF-α(P<0.001)的表达。5.HF抑制了EAE小鼠脊髓内p-NF-κB/p65的表达(P<0.05),而且降低了COX-2和i NOS的水平(P<0.05,P<0.05)。6.体外实验结果显示:HF降低了脾MNCs培养上清液中炎性细胞因子IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-1β的浓度(P<0.05),并抑制了趋化因子MIP-1a(p<0.05)、MCP-1(P<0.01)、RANTES(P<0.01)的表达。结论:1.成功制备MOG35-33诱导的小鼠EAE模型;2.HF可延迟EAE小鼠模型的发病时间,改善CNS的髓鞘脱失,减轻临床症状的严重性;3.HF通过减少脾细胞中趋化因子的表达起到抑制炎性细胞向CNS浸润的作用;4.HF通过促进T细胞各亚群间的平衡而发挥免疫调节作用;5.HF通过下调致炎性细胞因子,促进巨噬细胞表型由M1向M2型转变,并抑制NF-κB的活化,下调i NOS和COX-2的表达起到缓解神经炎性反应的作用。第四部分羟基法舒地尔、盐酸法舒地尔治疗双环己酮草酰二腙诱导的脱髓鞘模型的疗效比较及作用机制研究目的:比较HF与盐酸法舒地尔对CPZ诱导的脱髓鞘小鼠模型的治疗效果,并探究其作用机制。方法:将雄性C57BL/6小鼠随机分为四组:正常组:接受常规饲料喂养6周;CPZ模型组:投喂含0.2%CPZ(w/w)的饲料6周;盐酸法舒地尔治疗组:投喂含0.2%CPZ(w/w)的饲料6周,于造模四周后给予腹腔注射盐酸法舒地尔(40mg/kg/d);HF治疗组:投喂含0.2%CPZ(w/w)的饲料6周,于造模四周后给予腹腔注射HF(40mg/kg/d)。正常组及CPZ模型组于四周后给予腹腔注射等量生理盐水。于实验结束时应用高架十字迷宫(EPM)和垂直木实验来检测小鼠的焦虑水平和运动能力。应用LFB和黑金染色(Black GoldⅡ,BGⅡ)对脑冰冻切片进行染色,以及Western blot法检测髓鞘碱性蛋白MBP的表达,免疫荧光染色法检测MBP的表达以及脑内成熟少突胶质细胞的数量来评估CPZ小鼠脑内髓鞘的脱失程度。分离脾脏并称取重量,制备脾MNCs,一部分MNCs通过流式细胞术检测T细胞亚群的分布、B细胞的比例;另一部分脾MNCs在含有MOG35-55(10μg/ml)的培养液中培养48小时。采用ELISA法检测各组小鼠脑内、血清以及脾MNCs培养上清液中细胞因子的浓度。应用ELISA法检测血清、脾MNCs培养上清液以及脑组织中的抗-MOG抗体,并应用Dot blot法和免疫荧光染色法检验其特异性。通过免疫荧光染色法,检测脑内抗-CD4、CD68、B220、Iba-1、i NOS,NF-κB和BDNF的表达。结果:1.与正常组相比,CPZ模型组小鼠表现出明显的行为学的改变,EPM检测结果显示,CPZ模型组小鼠进入闭合臂的次数明显增加(正常组为4.75±0.93,CPZ模型组为10.08±1.89,P<0.01)。同CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔组(6.58±1.04)及HF组(5.83±0.79)有效地减少了CPZ小鼠进入闭合臂的次数(P<0.05,P<0.05),但是盐酸法舒地尔组及HF组之间无显着差异。垂直木检测结果显示CPZ模型组小鼠自检测装置顶端至底部所需时间较正常组明显增加,正常组为(5.72±0.83)s,CPZ模型组为(15.29±1.24)s,P<0.01。与CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔组为(11.71±1.01)s,P<0.05,HF组为(10.14±1.10)s,P<0.05,有效地改善了CPZ小鼠的运动能力。但是盐酸法舒地尔组及HF组之间的差异未达到统计学意义。2.同正常组相比,CPZ模型组小鼠脑内胼胝体区LFB光密度、BGⅡ染色密度及MBP的表达均明显降低(P<0.001)。同CPZ模型组相比,HF组及盐酸法舒地尔组各染色法结果均显示小鼠脑内髓鞘的脱失明显减轻(P<0.01,P<0.001)。盐酸法舒地尔组BGⅡ染色法的光密度值高于HF组,该差异具有统计学意义(P<0.05)。3.CPZ模型组小鼠脑蛋白中MBP含量比正常组减少(P<0.001)。同CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔组及HF组脑蛋白中MBP的含量明显增加(P<0.001)。盐酸法舒地尔组MBP的表达高于HF组,差异显着,具有统计学意义,P<0.05。同正常组相比,CPZ模型组O4+少突胶质细胞数量明显减少(正常组为396.61±29.74,CPZ模型组94.23±9.23,P<0.001)。盐酸法舒地尔组(255.80±25.11)及HF组(258.24±26.37)较CPZ模型组相比,可有效增加O4+少突胶质细胞的数量(P<0.001)。盐酸法舒地尔组及HF组之间无显着差异。4.CPZ组小鼠的脾脏质量较正常组明显减小,正常组为(113.50±14.92)g,CPZ模型组为(57.13±2.65)g,P<0.001。盐酸法舒地尔组脾脏质量为(70.77±5.16)g,HF组为(65.83±3.04)g,同CPZ模型组相比,二者均可部分程度上改善CPZ所诱导的脾脏萎缩(P<0.05)。盐酸法舒地尔组及HF组之间差异不显着。5.通过ELISA法于CPZ小鼠的血清、脾MNCs培养上清液以及脑蛋白中均检测到抗-MOG抗体,同正常组相比,差异具有统计学意义(P<0.001,P<0.01,P<0.05),盐酸法舒地尔及HF可显着抑制CPZ小鼠血清、脾MNCs培养上清液以及脑蛋白中抗-MOG抗体的浓度(P<0.001,P<0.01),并且同盐酸法舒地尔相比,HF对抗-MOG抗体的抑制作用更强,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。应用Dot blot法检验不同稀释比例的血清中抗-MOG抗体的表达,CPZ模型组显着高于正常组,P<0.001,盐酸法舒地尔和HF表现出对该抗体的有效抑制,与CPZ模型组相比差异显着(P<0.001,P<0.01)。HF较盐酸法舒地尔的抑制作用更显着(P<0.05)。通过免疫荧光染色法验证了抗-MOG抗体可特异性地与少突胶质细胞结合。应用流式细胞术分析脾MNCs中B淋巴细胞亚群的比例,正常组、CPZ模型组、盐酸法舒地尔组及HF组分别为:(52.37±0.52)%,(62.17±0.13)%,(54.87±0.59)%,(52.97±0.23)%,与正常组相比,CPZ模型组的B220+B细胞比例增加(P<0.001)。而与CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔及HF可抑制这一改变(P<0.001),并且HF组同盐酸法舒地尔组相比,该比例更低,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.在CPZ模型小鼠脑内,可观察到CD4、CD68以及B220阳性的T淋巴细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞的表达,同正常组相比,差异显着(P<0.001)。盐酸法舒地尔及HF可显着抑制上述细胞向CPZ小鼠脑内的浸润(P<0.001)。7.同正常组相比,CPZ模型小鼠脑内胼胝体区以及纹状体区可见Iba-1+小胶质细胞的数量的显着增加(P<0.001);与CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔及HF可有效地减少CPZ小鼠脑内该细胞的数量(P<0.001);盐酸法舒地尔组及HF组之间无显着差异。应用双染技术,可见CPZ模型组小鼠脑内Iba-1+i NOS+以及Iba-1+NF-κB+的细胞数量较正常组明显增加(P<0.001),盐酸法舒地尔及HF可有效地减少CPZ小鼠脑内上述炎性细胞的数量,同CPZ模型组相比,差异显着,P<0.001,而盐酸法舒地尔及HF组之间无显着差异。盐酸法舒地尔及HF尚可抑制脑内炎性细胞因子IL-4(P<0.001)、IL-1β(P<0.001)和TNF-α的水平。8.HF促进了星形胶质细胞来源的BDNF的产生。结论:1.HF及盐酸法舒地尔可通过抑制抗-MOG特异性抗体的产生,抑制小胶质细胞介导的神经炎症、抑制外周炎性细胞浸润进而改善炎性微环境等作用来发挥对CPZ模型髓鞘的保护作用。2.HF还可促进神经营养因子的产生来促进髓鞘的再生。此外,同盐酸法舒地尔相比,HF表现出更强的抑制抗-MOG抗体的作用。结论1.HF的细胞毒性及其对细胞活性、细胞形态的影响呈浓度依赖型表现。2.HF的最大耐受剂量高于盐酸法舒地尔,具有较好的安全性。3.HF可改善EAE模型的临床症状,减轻脊髓中炎性细胞浸润,改善髓鞘脱失,并通过调节免疫、抑制神经炎性反应等途径发挥作用。4.HF及盐酸法舒地尔可通过抑制抗-MOG特异性抗体的产生,抑制小胶质细胞介导的神经炎症、改善炎性微环境,促进神经营养因子的产生等作用来发挥对CPZ模型的髓鞘保护以及促进髓鞘再生的作用。5.HF作为盐酸法舒地尔在体内的活性代谢产物,二者在治疗CPZ模型中疗效相近,但是同盐酸法舒地尔相比,HF具有对抗-MOG特异性抗体的抑制作用更强、毒性更低、不良反应更低的优势,具有很大的潜在应用价值。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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