黑曲霉cpeB和catA基因对氧化应激和果实致病性的调控机制研究

论文摘要

黑曲霉（Aspergillus niger）,一种在自然界普遍存在的丝状真菌,因其可以产生有机酸、酶类和多种次级代谢产物,故在工业生产中具有重要的应用价值;同时作为一种典型的致腐真菌,能够造成食品、植物、果蔬的腐烂变质。外界氧化胁迫导致黑曲霉细胞内活性氧（ROS）的大量积累,为抵抗ROS造成的氧化损伤,黑曲霉抗氧化系统中的过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）在其中发挥着重要作用。本论文利用同源重组原理,结合原生质体转化技术,构建黑曲霉ΔcpeB、ΔcatA、ΔcpeB-ΔcatA和ΔcpeB-ΔsodC缺失体,以探究黑曲霉中cpeB和catA基因对氧化应激和果实致病性的调控机制。主要研究结果如下:首先,对过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因cpeB在氧化应激和对果实的致病力中的作用进行了探究。鉴于cpeB基因可能参与黑曲霉的抗氧化代谢过程,利用RT-qPCR技术对cpeB基因在氧化应激反应中的作用进行探究,发现在外源H2O2胁迫下,黑曲霉cpeB基因的相对表达量是正常条件下的3.87倍。通过对过氧化氢酶-过氧化物酶cpeB进行生物信息学分析,发现cpeB一级结构包含两个过氧化物酶（POD）结构域,ΔcpeB缺失菌株的CAT和POD的酶活测定结果表明ΔcpeB突变体的CAT活性比野生型低22%,而POD活性与野生型相比却没有显著变化。此外,通过native-PAGE技术对ΔcpeB缺失菌株进行CAT酶活性电泳,发现ΔcpeB缺失菌株CAT活性显著降低。上述结果表明,cpeB尽管结构上是一个潜在的POD酶,但它缺乏POD活性,而具有显著的CAT活性。同时,在H2O2胁迫下,ΔcpeB突变体的菌丝体生长显著慢于野生型,而在6 mM H2O2条件下孵育10 h后测定孢子的萌发情况,发现ΔcpeB突变体孢子的萌发率仅为野生型的17%。然而ΔcpeB突变体对重金属离子Cd2+、Cu2+、Al3+以及超氧阴离子供体甲萘醌却没有更高的敏感性,表明黑曲霉cpeB基因在H2O2应激反应的特殊作用,而对于细胞适应其他胁迫镉、铜、铝和甲萘醌是非必需的。另外,在H2O2处理过程中,通过对氧化代谢相关物质的检测,结果显示ΔcpeB突变体中MDA、H2O2和·O2-显著增加,表明ΔcpeB突变体在分解H2O2中的缺陷导致黑曲霉细胞的膜质过氧化和ROS的损伤。鉴于黑曲霉是苹果果实的潜在致病菌,本文对黑曲霉中cpeB基因是否参与苹果果实的侵染进行研究。通过将黑曲霉野生型和ΔcpeB突变体接种在苹果果实中以评估它们的致病性,结果表明,与野生型相比,ΔcpeB突变体在苹果果实上的菌斑直径减少了20%左右。进一步对接种黑曲霉野生型和ΔcpeB突变体的苹果果实中MDA含量和ROS代谢物进行测定发现,侵染野生型后的苹果果实比侵染ΔcpeB突变体后MDA、H2O2的含量和·O2-的产生速率均显著增加。此外,我们进一步测定了侵染苹果过程中野生型和ΔcpeB突变体孢子中CAT家族基因的表达情况,发现与野生型相比,ΔcpeB突变体中编码CAT的基因An02g02750、An03g05660、An08g08920和cat1显著上调。以上结果表明ΔcpeB菌株对苹果果实的致病性较野生型显著降低,尽管其他一些CAT家族基因的表达水平上调,但仍不能补偿cpeB的重要功能,这表明cpeB基因在黑曲霉对侵染苹果果实的致病力方面发挥着重要作用。为研究cpeB与CAT编码基因catA是否共同参与黑曲霉氧化应激响应和对采后水果的致病力,以及cpeB和sodC基因在抗氧化机制中的上下游关系,以ΔcpeB、ΔcatA和ΔsodC为材料,构建ΔcpeB-ΔcatA和ΔcpeB-ΔsodC双突菌株。通过对ΔcpeB-ΔcatA缺失体的活性测定和同工酶活性电泳发现,cpeB和catA均具有CAT酶活,但是两者对于总的CAT酶活的贡献不同,cpeB在CAT的全酶活中起主要作用。在重金属、H2O2和甲萘醌的敏感性测定实验中发现,cpeB和catA基因能够共同参与H2O2的分解,且两者的功能存在潜在的叠加现象。此外,通过对ΔcpeB-ΔcatA的致病力进行分析,结果表明,与野生型和单突ΔcatA、ΔcpeB相比,cpeB和catA基因的同时敲除并没有增加黑曲霉对采后水果的致病力。在获得ΔcpeB-ΔsodC后,测定了ΔcpeB-ΔsodC对重金属、H2O2和甲萘醌的敏感性,发现sodC基因仅对甲萘醌胁迫敏感,说明sodC基因参与甲萘醌的解毒。综上所述,CAT和SOD在黑曲霉氧化胁迫应答和菌植互作中发挥重要作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• abstract
• 第一章 前言
•   1.1 黑曲霉研究概述
•   1.2 病原真菌氧化应激和ROS的产生
•   1.3 植物免疫防御及致病真菌的响应机制
•   1.4 真菌中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的研究进展
•     1.4.1 过氧化氢酶在真菌中的研究进展
•     1.4.2 超氧化物歧化酶在真菌中的研究进展
•   1.5 真菌基因工程研究进展
•   1.6 课题研究的目的、意义及内容
•     1.6.1 研究目的与意义
•     1.6.2 研究内容
• 第二章 黑曲霉cpeB缺失体的构建及基因的功能研究
•   2.1 实验材料、试剂及仪器
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 总RNA的提取
•     2.2.2 cDNA的合成
•     2.2.3 引物的设计及RT-qPCR检测
•     2.2.4 黑曲霉cpeB基因的生物信息学分析
•     2.2.5 黑曲霉cpeB敲除载体的构建
•     2.2.6 黑曲霉原生质体的制备及聚乙二醇的转化
•     2.2.7 黑曲霉ΔcpeB突变体的筛选
•     2.2.8 ΔcpeB突变体的鉴定
•     2.2.9 黑曲霉ΔcpeB突变体过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性的检测
•     2.2.10 黑曲霉ΔcpeB突变体CAT同工酶活性电泳的检测
•     2.2.11 黑曲霉ΔcpeB突变体菌丝体生长状况的测定
•     2.2.12 黑曲霉ΔcpeB突变体生长曲线的测定
•     2.2.13 不同非生物胁迫下ΔcpeB突变体的敏感性测定
• 2O₂ 胁迫下孢子萌发的测定'>    2.2.14 H₂O₂胁迫下孢子萌发的测定
• 2O₂含量以及·O₂^-产生速率的测定'>    2.2.15 MDA、H₂O₂含量以及·O₂^-产生速率的测定
•     2.2.16 黑曲霉侵染采后果实能力的检测
•   2.3 结果与分析
• 2O₂ 胁迫下黑曲霉cpeB基因的应答'>    2.3.1 H₂O₂胁迫下黑曲霉cpeB基因的应答
•     2.3.2 黑曲霉cpeB基因的生物信息学分析
•     2.3.3 黑曲霉cpeB pC3-ABCD敲除载体的构建
•     2.3.4 黑曲霉cpeB缺失体的鉴定及酶活分析
•     2.3.5 黑曲霉野生型与cpeB缺失体生长状况的比较
•     2.3.6 ΔcpeB突变体对不同非生物胁迫的敏感性分析
• 2O₂对ΔcpeB突变体孢子萌发的影响'>    2.3.7 H₂O₂对ΔcpeB突变体孢子萌发的影响
• 2O₂胁迫下ΔcpeB体内MDA、H₂O₂含量以及·O₂^-产生速率的分析'>    2.3.8 H₂O₂胁迫下ΔcpeB体内MDA、H₂O₂含量以及·O₂^-产生速率的分析
•     2.3.9 黑曲霉WT与 cpeB缺失体对苹果果实的致病性分析
•   2.4 本章小结
• 第三章 cpeB-catA双基因突变体的构建及其抗氧化功能和对果实的致病性研究
•   3.1 实验材料、试剂及仪器
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器
•   3.2 实验方法
• 2O₂胁迫下CAT家族基因的表达量'>    3.2.1 RT-qPCR测定H₂O₂胁迫下CAT家族基因的表达量
•     3.2.2 黑曲霉CAT家族基因进化树的构建
•     3.2.3 黑曲霉catA、An03g05660和An14g07200 敲除载体的构建
•     3.2.4 ΔcatA和 ΔcpeB-ΔcatA突变体的鉴定
•     3.2.5 可溶性蛋白含量的测定
•     3.2.6 过氧化氢酶（CAT）同工酶活性电泳的检测
•     3.2.7 黑曲霉对不同非生物胁迫的敏感性测定
•     3.2.8 扫描电子显微镜观察黑曲霉菌丝形态
•     3.2.9 黑曲霉野生型和突变体对果实侵染能力的测定
•   3.3 结果与分析
• 2O₂胁迫下CAT家族编码基因的应答'>    3.3.1 H₂O₂胁迫下CAT家族编码基因的应答
•     3.3.2 CAT家族基因进化树分析
•     3.3.3 catA、An03g05660、An14g07200 基因侧翼片段AB、CD的扩增及纯化
•     3.3.4 片段ABCD的扩增
•     3.3.5 ABCD片段和pC3 质粒的酶切
•     3.3.6 ABCD片段与pC3 质粒的连接及鉴定
•     3.3.7 ΔcpeB-ΔcatA双基因缺失体的鉴定及酶的活性分析
•     3.3.8 ΔcpeB-ΔcatA对不同非生物胁迫的敏感性分析
• 2O₂ 对黑曲霉菌丝超显微形态的影响'>    3.3.9 H₂O₂对黑曲霉菌丝超显微形态的影响
•     3.3.10 ΔcpeB-ΔcatA对采后水果的致病性分析
•   3.4 本章小结
• 第四章 cpeB-sodC双突的构建及其对黑曲霉抗氧化能力的影响
•   4.1 实验材料、试剂及仪器
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 ΔcpeB-ΔsodC双突变体的筛选及鉴定
•     4.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）同工酶活性电泳的检测
•     4.2.3 ΔcpeB-ΔsodC对不同非生物胁迫的耐受力测定
•     4.2.4 甲萘醌胁迫下SOD家族基因的表达水平的测定
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 ΔcpeB-ΔsodC缺失体的鉴定及酶活分析
•     4.3.2 ΔcpeB-ΔsodC对不同非生物胁迫的耐受力分析
•     4.3.3 黑曲霉野生型和ΔsodC中 SOD家族编码基因对甲萘醌胁迫的应激响应
•   4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张梦可

导师: 张华

关键词: 黑曲霉,基因,氧化应激,致病力

来源: 合肥工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 合肥工业大学

分类号: Q943.2

总页数: 80

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