遵义医药高等专科学校微生物与免疫学教研室563002
摘要：目的提供一种安全、简单、易于制作的标本制备方法。方法在液体培养基中加入吐温-80破坏分枝杆菌的索状因子，使其在培养基中形成分散浑浊生长，经高压灭菌后加入背景成分。结果细菌含量比临床标本多，细菌形态、排列与临床标本无差异，背景效果好。结论该方法安全、简单、易于制作，教学效果较好。
关键词：抗酸染色；教学；标本制备
抗酸杆菌由于细胞壁含有大量脂类，能够抵抗盐酸酒精的脱色，存在不易着色和脱色的特点[1]。所采用常规的苏木素-曙红染色无法把细菌明显鉴别出来。目前，抗酸染色作为微生物学一种特殊鉴别染色方法，大量用于医学生的微生物学实验教学和临床诊断，虽然对临床诊断有所提高，但该法既不易完全脱色，而且操作繁琐费时。本文介绍一种实用、安全的标本制作方法供实验教学和临床诊断参考。
1材料
酸性液体培养基参照文献[2]，吐温-80（重庆川江化学试剂厂），抗酸染色液参照文献[2]自行配制，卡介苗来源于疾控中心，分支杆菌菌种为生产卡介苗用的牛型结核分枝杆菌94001。
2方法
2.1参照文献[2]制备酸性液体培养基，三角烧瓶装，每瓶100毫升；另用酸性液体培养基90毫升，加入10毫升吐温-80混合（也可分开包装高压灭菌后再加入培养基混合）；包扎后高压灭菌。有吐温-80和没有吐温-80的酸性液体培养基各取一瓶，分别接种结核分枝杆菌94001；一周后可见无吐温-80一瓶为生长形成较厚菌膜，加入吐温-80的培养基为浑浊生长，取出后高压灭菌。
2.2将菌膜生长的结核分枝杆菌倒入碾钵中加入石英砂进行碾磨，连续碾磨12小时为标本Ⅰ；同时另用一个碾钵中放入用于预防接种的卡介苗10支，也加入石英砂同样碾磨，连续碾磨12小时为标本Ⅱ。在经高压灭菌的浑浊生长的结合分支杆菌中加入蛋清20毫升，用玻璃棒涤打混匀为标本Ⅲ；再到附属医院检验科经浓缩法检查的抗酸染色阳性痰标本为标本Ⅳ。
2.3上述标本经抗酸染色参照文献[2]，显微镜检查。
3结果
未加吐温-80酸性液体培养基培养的分枝杆菌经石英砂碾磨标本和卡介苗加石英砂碾磨标本，镜下均可见大量抗酸性细菌，大量成堆，块状出现；可见少许蓝色背景。
4讨论
近几年结核病的发病率逐渐上升，抗酸染色是检测和诊断结核病重要的方法之一，但是抗酸染色质量会受到染色试剂和染色技术的影响[3]。分枝杆菌在未加吐温-80的酸性液体培养基中，在索状因子的作用下形成索状生长，同时分枝杆菌其脂质含量高，又是需氧菌，使其在液体培养基中形成在液体表面的菌膜生长。在使用石英砂碾磨时很难使其分散开来，从而使医院临床标本，镜下可见抗酸性细菌，但数量很少，学生不认识，也不易看见。使用未加吐温-80酸性液体培养基培养出来的分枝杆菌经石英砂碾磨在镜下可见大量抗酸性细菌，大量成堆，块状出现；可见少许蓝色背景。
在酸性液体培养基中加入吐温-80培养分枝杆菌，吐温-80抑制分枝杆菌索状因子的作用[4]，使其在培养基中不连接成索状生长，而形成分散成浑浊生长，在标本中加入一定的蛋白成分（蛋清）提高背景颜色；镜下可见大量抗酸性细菌，未见成堆或块状出现，有明显分枝状排列，细菌形态与排列与临床标本无差异；背景蓝色。
临床标本缺乏对教师、学生的生物安全，收集标本也存在一定困难，在教学过程中学生本来就不认识抗酸菌在镜下的形态，数量很少，学生就难以看见。
综上所述本文介绍的标本制作方法，在教学效果上优于传统的卡介苗碾磨制作法和临床标本，在安全上优于临床标本，更易于制作。而值得推广应用。
参考文献：
[1]张卓然临床微生物学和微生物检验[M]北京：人民卫生出版社，2003：15
[2]张颖悟主编临床微生物学大连出版社1990年
[3]庞霞、尹玉慧等改良改良抗酸染色法的经验交流[J]中国药物经济学，2012，12（3）175-176.
[4]李凡、刘晶星医学微生物学第七版人民出版社150--158