细菌耐药靶酶VanX和MβLs的活性评价与抑制研究

论文摘要

抗生素广泛用于细菌感染的治疗。但是,抗生素的过度使用和滥用加剧了细菌产生耐药性的速度,从而导致了人类和动物的高发病率和死亡率。耐药细菌抵抗几乎所有的抗生素,包括青霉素类、头孢类、碳青霉烯类、以及被誉为“最后一道防线”的糖肽类抗生素。尤其是D-D二肽酶VanX及金属β-内酰胺酶（MβLs）介导的超级细菌使得几乎所有的抗生素失去了效力,导致临床医学危机。鉴于细菌耐药研究的重要性,本论文开展了以下工作:1、D-D二肽酶VanX是革兰氏阳性菌耐万古霉素的靶酶。由于缺乏发色底物,对VanX的连续活性评价成为了一项挑战性工作。本文建立了一种等温滴定微量热（ITC）方法,用于VanX及其耐药细菌的实时活性评价与抑制,进而测得VanX水解D-Ala-D-Ala的热动力学参数Km（0.29 mM）和kcat(37.3 s-1)及其D-半胱氨酸抑制剂的抑制常数Ki（20.8μM）。通过ITC测得的这些热/动力学参数与镉茚三酮法测定及文献报道的数据一致。本文通过ITC表征了耐药细菌（包括临床菌）活菌体内VanX的活性及其抑制。结果显示,D-半胱氨酸可有效抑制大肠杆菌和耐万古霉素粪肠球菌（VRE）体内之VanX,其IC50值分别为29.8和28.6μM。同时,通过ITC,测得VRE和粪肠球菌水解D-Ala-D-Ala的表观焓变（-10.5和-0.017 kJ/mol）与万古霉素对这两株菌的MIC结果（512和4μg/mL）具有良好的相关性。2.设计合成了8种席夫碱类MβLs抑制剂,并对其进行了1H、13C NMR和MS表征。生物活性评价结果表明,其中4种化合物对MβLs NDM-1和VIM-2具有良好的抑制效果(IC50=0.16-12μM)。值得指出的是,这4种化合物可协同抗生素有力地抑制产MβLs的耐药细菌,使得抗生素的MIC值降低2-128倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 抗生素的发展及细菌耐药
•   1.2 β-内酰胺类抗生素及其耐药机理
•   1.3 万古霉素及其耐药机理
•   1.4 金属β-内酰胺酶（MβLs）
•   1.5 D-D二肽酶VanX
•   1.6 等温滴定微量热（ITC）简介
•   1.7 选题意义及研究内容
•   参考文献
• 第二章 D-D二肽酶VanX的ITC活性评价和抑制研究
•   2.1 研究背景
•   2.2 实验材料与方法
•     2.2.1 实验仪器
•     2.2.2 实验试剂
•     2.2.3 实验所用溶液及其配置方法
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 D-D二肽酶VanX的表达与纯化
•     2.3.2 VanX酶动力学
•     2.3.3 VanX酶抑制动力学评价
•     2.3.4 VanX酶活性的ITC评价
•     2.3.5 VanX酶活性抑制的ITC评价
•     2.3.6 耐药细菌活菌体内VanX活性的ITC评价
•     2.3.7 耐药细菌活菌体内VanX活性抑制的ITC评价
•     2.3.8 MIC测定
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 VanX酶的纯化与表征
•     2.4.2 VanX酶动力学表征
•     2.4.3 VanX酶活性的抑制表征
•     2.4.4 VanX酶活性ITC研究
•     2.4.5 VanX酶抑制ITC研究
•     2.4.6 耐药细菌活菌体内VanX活性ITC表征
•     2.4.7 耐药细菌活菌体内VanX抑制ITC表征
•     2.4.8 万古霉素对VRE及粪肠球菌敏感性的ITC表征
•   2.5 本章小结
•   参考文献
• 第三章 席夫碱类金属β-内酰胺酶抑制剂的合成及其活性研究
•   3.1 研究背景
•   3.2 席夫碱的合成
•     3.2.1 席夫碱的合成路线及其结构
•     3.2.2 仪器与试剂
•     3.2.3 席夫碱的合成及表征
•   3.3 席夫碱的生物活性评价
•     3.3.1 仪器与试剂
•     3.3.2 席夫碱对金属β-内酰胺酶的抑制活性评价
•     3.3.3 席夫碱协同抗生素的抑菌活性评价
•     3.3.4 细胞毒性实验
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 席夫碱的合成与表征
•     3.4.2 金属β-内酰胺酶的纯化与表征
•     3.4.3 席夫碱对金属β-内酰胺酶的抑制研究
•     3.4.4 席夫碱协同抗生素的抑菌研究
•     3.4.5 细胞毒性实验研究
•   3.5 本章小结
•   参考文献
• 全文总结
• 附录
• 攻读硕士学位期间取得的科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吕苗

导师: 杨科武

关键词: 细菌耐药,等温微量热滴定,抑制剂,金属内酰胺酶

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 西北大学

分类号: R378;Q55

总页数: 88

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