苹果B-boxl（MdBBXl）蛋白响应非生物胁迫的研究

论文摘要

B-box （BBX）蛋白是一类包含B-box结构域的锌指转录因子,在动、植物中参与基因的表达调控。植物BBX蛋白在幼苗光形态建成、开花调控以及植物激素转导过程中发挥重要作用。近年发现拟南芥的一个BBX蛋白（AtBBX5）与植物抵抗非生物胁迫有关。本实验室在前期苹果胁迫转录组中发现MdBBX1在盐胁迫下表达量明显上调,但它是否与植物抗胁迫功能有关尚不清楚。本文通过荧光定量PCR技术对该基因在苹果幼苗中不同胁迫条件下的表达量进行了分析;克隆该基因后,在原核细胞中诱导表达该蛋白,探究了重组表达MdBBX1对大肠杆菌抵抗非生物胁迫能力影响;在拟南芥中超表达MdBBX1,探究其是否具有增强拟南芥抵抗非生物胁迫的能力,并进一步探讨该基因参与植物应对非生物胁迫的应答机制。主要研究结果如下:（1） MdBBX1的生物信息学分析。实验室前期结果发现MdBBX1在盐胁迫下诱导表达上调10倍左右,MdBBX1的编码基因在GenB ank中的注册号为LOC103442491,该基因定位在苹果第1条染色体上,其cDNA全长为1023 bp,包含长度为1020 bp的开放阅读框,编码含有340个氨基酸残基的多肽链,预测其分子量为38.139 kDa,等电点为6.01。同源序列比对及蛋白聚类分析表明,MdBBX1在氨基末端包含两个B-box结构域,在羧基末端含有一个保守的CCT结构域,是一个典型的BBX蛋白。（2） MdBBX1的亚细胞定位与组织表达模式分析。将MdBBX1与GFP基因融合后转化烟草叶片,结果显示MdBBX1定位在细胞核中,与其他已知的植物BBX的亚细胞定位相同,也与BBX蛋白作为转录因子参与基因表达调控的结论相吻合。利用qRT-PCR技术,探究了 MdBBX1在苹果不同组织中的表达情况,发现MdBBX1在根、茎、叶、花、果器官中均有不同程度的表达,其中在叶中的表达量最高。（3）MdBBX1在苹果幼苗中受多种非生物胁迫的诱导表达。利用在线软件PlantCare对MdBBX1启动子序列进行了预测分析,发现存在多种与胁迫响应相关的元件,如ABRE元件、MBS元件、LTR元件、P-box元件等,推测该基因的表达响应非生物胁迫。对1年生苹果幼苗进行各种胁迫处理,发现在NaCl、PEG、4℃和外源ABA条件下胁迫处理后,MdBBX1表达量均有一定程度的上调,其中在ABA处理后,MdBBX1在苹果根中的表达量上调120倍左右,PEG处理后,MdBBX1在苹果叶片中的表达量上调20倍左右,结果表明MdBBX1的表达受非生物胁迫的诱导。（4）重组表达MdBBX1可以提高大肠杆菌的抗非生物胁迫能力。在分别含有NaCl、KCl以及甘露醇的固体胁迫培养基上,培养重组表达MdBBX1的大肠杆菌,以转化空质粒的菌株为对照,结果显示MdBBX1的表达明显提高了细胞的抗非生物胁迫能力,其菌落数明显多于对照;在分别含有NaCl、KCl以及甘露醇液体胁迫培养基中,MdBBXl表达也明显提高大肠杆菌了对胁迫的耐受性,其生长速度显著高于对照,比对照提前4 h进入对数生长期。固体胁迫与液体胁迫培养都表明MdBBX1可以提高大肠杆菌在非生物胁迫条件下的忍耐能力。（5）拟南芥中表达MdBBX1提高了其对不同非生物胁迫的耐受性。利用花序浸染法获得了稳定遗传的T3代MdBBX1超表达纯合株系。正常生长条件下,MdBBX1超表达植株（OE）与野生型植株（WT）的种子萌发率及生长状态无明显差别,但在分别含有NaCl、Manntiol和外源ABA培养基上,OE种子的发芽快且萌发率显著高于WT,OE植株的根长也明显比WT的长,对20 d苗龄的拟南芥分别进行NaCl、PEG胁迫处理后,OE出现叶片萎蔫、黄化现象时间晚且程度轻,其存活率显著高于WT植株;NBT染色实验发现,OE植株中O2-积累量明显低于WT植株。结果表明MdBBX1的表达可以提高拟南芥抗非生物胁迫的能力。（6） MdBBX1提高植物抗逆性与ABA信号途径及活性氧（ROS）途径有关。为探究MdBBX1的抗逆机制,我们检测了胁迫处理前后OE植株与WT植株中ABA信号途径以及ROS途径中相关基因的表达量变化。用250 mM的NaCl溶液处理后,WT植株与OE植株中ABA信号途径相关基因ABA1、ABA2、NCED3、RD29A以及ROS清除途径相关基因SOD、CAT的表达量都有所提高,但是OE植株与WT植株相比,相关基因的表达倍数上调更加显著,说明MdBBX1可能通过ABA信号途径与ROS途径参与胁迫响应。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 植物锌指转录因子的结构与功能
•     1.1.1 植物锌指转录因子的结构
•     1.1.2 植物锌指转录因子的功能
•   1.2 BBX家族研究进展
•     1.2.1 BBX蛋白家族的结构与分类
•     1.2.2 BBX蛋白的进化
•   1.3 植物BBX家族的生物学功能
•     1.3.1 BBX蛋白参与幼苗光形态发生
•     1.3.2 BBX蛋白调控植物开花
•     1.3.3 BBX蛋白调控植物避荫反应
•     1.3.4 BBX蛋白参与植物激素信号转导过程
•     1.3.5 BBX蛋白参与生物胁迫与非生物胁迫的响应
•   1.4 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株和质粒
•     2.1.2 酶及各种生化试剂
•     2.1.3 引物
•     2.1.4 软件和数据库资源
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 MdBBX1非生物胁迫条件下的表达分析
•       2.2.1.1 植物材料的培养及处理
•       2.2.1.2 苹果样品中叶片和根系RNA提取
•       2.2.1.3 苹果RNA反转录
•       2.2.1.4 实时荧光定量PCR
•     2.2.2 MdBBX1原核表达载体的构建
•       2.2.2.1 MdBBX1的克隆
•       2.2.2.2 MdBBX1克隆载体的构建
•       2.2.2.3 MdBBX1原核表达载体的构建
•     2.2.3 MdBBX1植物表达载体的构建与转化
•       2.2.3.1 MdBBX1植物表达载体的构建
•       2.2.3.2 农杆菌感受态细胞的制备
•       2.2.3.3 农杆菌感受态细胞的转化
•     2.2.4 拟南芥MdBBX1超表达纯合株系的获得与鉴定
•       2.2.4.1 农杆菌介导的拟南芥花序浸染法转化拟南芥
•       2.2.4.2 CTAB法提取拟南芥基因组
•       2.2.4.3 MdBBX1转基因植株纯合体的筛选与鉴定
•     2.2.5 MdBBX1超表达植株中的相关基因的表达分析
•       2.2.5.1 植物材料的处理
•       2.2.5.2 Trizol法提取拟南芥总RNA
•       2.2.5.3 cDNA反转录和荧光定量PCR
•     2.2.6 MdBBX1亚细胞定位
• 2^·-含量'>    2.2.7 NBT染色检测O₂^·-含量
• 3 结果与分析
•   3.1 MdBBX1亚细胞定位、组织表达模式及启动子分析
•     3.1.1 MdBBX1生物信息学分析
•     3.1.2 MdBBX1亚细胞定位分析与MdBBX1组织表达分析
•     3.1.3 MdBBX1启动子分析与胁迫响应分析
•   3.2 重组表达MdBBX1提高了原核细胞的抗逆性
•     3.2.1 固体胁迫培养中重组表达MdBBX1提高了大肠杆菌的生存能力
•     3.2.2 液体胁迫培养下重组表达MdBBX1提高了大肠杆菌的生存能力
•   3.3 超表达MdBBX1提高了拟南芥对非生物胁迫的抗性
•     3.3.1 拟南芥MdBBX1超表达纯合株系的获得与鉴定
•     3.3.2 超表达MdBBX1增强了拟南芥对盐胁迫的抗性
•     3.3.3 超表达MdBBX1增强了拟南芥对渗透胁迫的抗性
•   3.4 MdBBX1与脱落酸信号转导途径有关
•     3.4.1 超表达MdBBX1降低了拟南芥对外源ABA的敏感性
•     3.4.2 MdBBX1超表达影响ABA信号途径相关基因的表达
•   3.5 MdBBX1与胁迫条件下的活性氧代谢途径有关
• 4 讨论
•   4.1 MdBBX1的亚细胞定位
•   4.2 MdBBX1的表达受多种非生物胁迫的诱导
•   4.3 MdBBX1的表达增强了大肠杆菌与植物对多种非生物胁迫的耐受力
•   4.4 MdBBX1通过ABA信号途径参与胁迫应答
•   4.5 MdBBX1通过ROS代谢途径参与胁迫应答
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文及成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 戴亚青

导师: 王晓云

关键词: 蛋白,非生物胁迫,苹果

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山东农业大学

分类号: Q945.78

总页数: 71

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