基于CRISPR/Cas12a的食气扬氏梭菌基因组编辑工具的建立与应用

论文摘要

大部分细菌和几乎所有古生菌的基因组中,都存在着一种规律排列成簇的短回文重复序列CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）,由 spacer和repeat间隔排列组成。这种重复序列的相邻位置往往是一些CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins）Cas的编码基因,这类蛋白具有核糖核酸内切酶的功能,与CRISPR转录出的导向性RNA共同形成这些微生物中的一种适应性免疫系统,即CRISPR-Cas系统,用于抵御外来病毒和噬菌体的入侵。基于该系统的特性,人们发展了一系列高效的基因编辑工具,在植物、动物、微生物中均得到广泛应用。Cas12a（又称Cpf1）属于Cas蛋白家族的ClassII typeV型蛋白,含有Ruvc结构域和Nuc结构域,同时具备DNA核酸酶活性和RNA核酸酶活性。与常用的Cas9不同的是,Cas12a不仅可以对靶标DNA进行切割,也可以对自身CRISPR转录的RNA前体进行切割加工,形成成熟的crRNA（CRISPRRNA）。而且Cas12a蛋白的分子量比Cas9蛋白小100个氨基酸,适配的PAM（protospacer adjacent motif）序列为5’-TTN-3’,而不是5’-NGG-3’,更适用于GC含量更低的物种,针对AT含量丰富的基因序列可选择的靶标位点更多,更具优势。扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）是食气梭菌的代表性菌株之一,具有Wood-Ljungdahl固碳途径,能够以CO、CO2气体为唯一碳源进行生长,并代谢产生有机酸和有机醇等,具有良好的工业应用前景。然而,扬氏梭菌作为一种低GC含量的革兰氏阳性菌,全基因组内的GC含量大约只有31%,可供CRISPR-Cas9系统识别的PAM序列较少,尤其是对于基因组上一些短小的序列而言,由于缺乏合适的PAM位点,研究者无法采用CRISPR-Cas9对其进行分子操作。而Cas12a蛋白识别的PAM是序列富含胸腺嘧啶的5’-TTN-3’,在扬氏梭菌基因组上出现的几率极高。因此,开发基于CRISPR-Cas12a的基因组编辑工具对于扬氏梭菌十分重要,可有效提高编辑效率和灵活性,弥补原有CRISPR-Cas9系统的缺陷和不足。本研究旨在扬氏梭菌中开发基于CRISPR-Cas12a的基因组编辑工具,用于实现基因敲除和基因表达抑制两个方面的目标。在这项研究中,我们首先从四种不同来源的Cas12a蛋白中筛选出针对扬氏梭菌毒性相对较小的蛋白——新凶手土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis subsp.novicida U112）FnCas12a蛋白,并通过体内实验验证了FnCas12a具有体内切割DNA双链的活性,适合在该菌中进行基因编辑工具的开发。因此,针对CRISPR-FnCas12a,构建了基因敲除系统的质粒,并基于改进的高效感受态制备方法,通过该敲除系统成功进行了pta（CLJUc12770编码磷酸乙酰转移酶的基因）、adhE1（CLJUc16510编码醇醛脱氢酶的基因）、ctf（CLJUc39430编码酰基辅酶A转移酶的基因）、pyrE（CLJUc35680编码乳清酸磷酸核糖转移酶的基因）四个基因的同框缺失。此外,还对FnCas12a蛋白的1006位氨基酸进行了替换,获得失去DNA切割功能的ddFnCas12a（Dead-DNaseFnCas12a）蛋白,开发了该蛋白介导的CRISPRi系统,有效地实现了目标基因的转录下调。具体使果糖培养条件下转录量靠前的四个基因CLJUc09110（编码厌氧一氧化碳脱氢酶催化亚基的基因）,CLJUc04990（编码表层蛋白质的基因）,CLJUc37650（编码甲酸—四氢叶酸连接酶的基因）以及CLJUc16510（编码双功能醛/醇脱氢酶的基因）分别产生99%、96%、88%、97%的下调。此外,通过这种基因抑制的方法,在整合了丁酸途径的工程菌株中抑制途径基因adhE1的表达,实现了碳流量的重新分布,根据总溶剂占比情况,乙醇、乙酸和丁酸的分布均有改变,乙醇比率从4.6%（对照）降至2.6%,丁酸比例从26.8%（对照）增加到32.1%,丁酸的产量在一定程度上得以提高,相比于对照组有20%的提升。综上,本研究在扬氏梭菌中建立了高效的遗传操作系统CRISPR-FnCas12a和CRISPR-ddFnCas12a,并将之应用于代谢途径中关键基因的敲除和干扰,为这一重要工业微生物的基础和应用研究提供了技术支撑。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 CRISPR-Cas系统
•     1.1.1 CRISPR-Cas系统的发现和应用
•     1.1.2 CRISPR-Cas系统的作用机制
•     1.1.3 CRISPR-Cas系统的分类
•   1.2 CRISPR-Cas12a
•     1.2.1 Cas12a与Cas9的比较
•     1.2.2 CRISPR-Cas12a系统在微生物基因编辑中的研究与应用
•   1.3 食气扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）
•     1.3.1 扬氏梭菌（Clostridium.ljungdahlii DSM 13528）的发现
•     1.3.2 扬氏梭菌分子遗传操作技术研究进展
•   1.4 本研究的目的意义及主要内容
• 第二章 扬氏梭菌基因编辑系统CRISPR-Cas12a的建立及基因敲除测试
•   2.1 前言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 菌株、质粒以及引物
•     2.2.2 仪器和试剂
•     2.2.3 测试蛋白毒性质粒构建以及基因切割质粒、敲除质粒构建
•     2.2.4 扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii DSM 13528）感受态细胞的制备
•     2.2.5 扬氏梭菌（Clostridium. ljungdahlii DSM 13528）高效感受态细胞制备方法优化
•     2.2.6 电穿孔转化以及菌株保藏
•     2.2.7 基因敲除的鉴定
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 Cas12a蛋白的选择
•     2.3.2 FnCas12a蛋白切割活性的测试
•     2.3.3 构建CRISPR-Cas12a基因敲除质粒
•     2.3.4 脱靶实验验证以及感受态效率的优化
•     2.3.5 基因敲除的测试
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• 第三章 扬氏梭菌基因干扰系统CRISPR/ddCas12a的建立及基因转录抑制的测试
•   3.1 前言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 菌株、质粒以及引物
•     3.2.2 仪器和试剂
•     3.2.3 基因抑制质粒的构建
•     3.2.4 扬氏梭菌（Clostridium. ljungdahlii DSM 13528）感受态制备
•     3.2.5 电穿孔转化以及菌株保藏
•     3.2.6 果糖发酵与合成气发酵实验
•     3.2.7 荧光定量RT-PCR分析
•     3.2.8 高效气相色谱分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 CRISPR/ddCas12a基因转录抑制系统的建立
•     3.3.2 基因抑制效果的测试
•     3.3.3 CRISPR-ddCas12a系统在丁酸工程菌中的应用
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 第四章 全文总结与展望
•   4.1 全文总结
•   4.2 展望
• 参考文献
• 附录A 常规实验方法
• 附录B 主要术语与缩写
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵然

导师: 姜卫红,王刚

关键词: 扬氏梭菌,基因编辑,基因抑制

来源: 河南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河南大学

分类号: Q78

总页数: 72

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