人工条件下鸡毛降解过程中真菌群落的动态变化

论文摘要

角蛋白是一种纤维性与难溶型的结构蛋白,是自然界中仅次于纤维素和几丁质的第三大丰富聚合物,角蛋白是构成皮肤、毛发、羽毛、角等的重要组成部分。降解后的角蛋白是丰富的蛋白质来源,可用于生产饲料或包覆膜材料以及生物医学材料等等。传统的物理化学降解角蛋白易对环境造成污染,所得产物也不理想,而微生物降解角蛋白是一种温和、高效、绿色的方法,具有广阔的发展潜力和极高的实用价值。本研究基于传统的真菌平板分离培养和高通量测序技术分析,分析医院绿地土壤加入无菌鸡毛粉后不同时期的真菌群落组成变化。筛选出一株对鸡毛粉角蛋白有高效降解能力的真菌,通过正交试验探索其最佳发酵条件。基于传统的真菌平板分离培养结果可知,加入富角蛋白的无菌鸡毛粉不同时期（初期3d、中期30d、后期90d）的医院绿地土壤中真菌群落组成有较大差异。通过经典的平板分类方法,从加入鸡毛粉的医院土中共分离到真菌372株,经形态特征和分子鉴定,它们分属19属33种。从医院绿地土分离获得的真菌类群中,初期（YY1）样本中分离到6属12种155株真菌,初期（YY1）样本的真菌优势类群是青霉属Penicillium,占分离真菌总数的59%。中期（YY2）样本中分离到10属15种134株真菌,中期（YY2）样本中蜡蚧属Lecanicillium是优势类群,占总数的48%。后期（YY3）样本中分离到7属11种83株真菌,后期（YY3）样本中真菌优势类群则是小孢子属Microsporum,占总数的53%。随着鸡毛的降解,不同时期内医院土中的真菌优势类群发生明显的动态变化。将富含角蛋白有机物的无菌鸡毛粉加入一医院的绿地土后,基于高通量测序技术分析真菌群落的组成及相对丰度,发现在富含角蛋白基质鸡毛粉降解过程中共有真菌6门15纲39目71科128属。加入鸡毛粉的不同时期（初期3d、中期30d、后期90d）医院土真菌群落结构发生较大的变化。添加鸡毛粉3d的医院土（YY1）中真菌群落多样性丰富,优势种是芽殖久浩酵母Guehomyces pullulans（57.42%）;加入鸡毛粉30d后（YY2）,群落组成中不少真菌群落的相对丰度明显下降,优势种为一分类地位未定的真菌属,其相对丰度是77.57%;加入鸡毛粉90d后（YY3）,一些潜在的人类病原真菌的相对丰度有所上升,真菌优势种是石膏样小孢子菌Microsporum gyseum（55.17%）,而初期的真菌优势种芽殖久浩酵母Guehomyces pullulans的相对丰度则明显的降低。研究表明富含角蛋白的鸡毛粉对医院绿地土壤中的真菌群落,特别是一些人体潜在病原真菌的相对丰度和群落组成具有明显的调节作用。基于传统的真菌平板分离培养的方法,从加入鸡毛粉中期的医院绿地土中分离到一株能够高效降解角蛋白的真菌GZZC1Y2-12,通过菌株形态特征和分子鉴定可知高效降解角蛋白菌株1Y2-12属于蜡蚧属Lecanicillium,根据ML系统发育树将该菌株命名为Lecanicillium testudineum。采用正交试验探索该菌株降解角蛋白的最佳发酵条件,结果可知,影响菌株1Y2-12产酶的各因素主次顺序为N源﹥无机离子﹥C源,其中N源对菌株发酵产酶活力的影响最显著。菌株1Y2-12产酶的最佳培养条件为A2B3C1,在此条件下菌株1Y2-12发酵产酶的值为22.03U/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 角蛋白
•     1.1.1 角蛋白的结构与特性
•     1.1.2 角蛋白的降解方法
•     1.1.3 角蛋白的应用
•   1.2 角蛋白酶
•     1.2.1 角蛋白酶的定义与分类
•     1.2.2 角蛋白酶基因的分子生物学研究
•     1.2.3 产角蛋白酶的微生物
•       1.2.3.1 真菌
•       1.2.3.2 细菌
•       1.2.3.3 放线菌
•   1.3 真菌对角蛋白的降解机制
•   1.4 不同生境中真菌群落的变化
•   1.5 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
•   2.1 研究材料
•     2.1.1 样品的制备
•     2.1.2 试验用具
•     2.1.3 仪器设备
•     2.1.4 试验试剂
•     2.1.5 乳酸石碳酸棉蓝染色液
•     2.1.6 培养基
•     2.1.7 本试验所用引物
•   2.2 研究方法
•     2.2.1 土样真菌的分离
•     2.2.2 真菌的形态鉴定
•     2.2.3 真菌的分子鉴定
•       2.2.3.1 真菌的DNA提取
•       2.2.3.2 PCR扩增及测序
•       2.2.3.3 PCR产物的检测
•       2.2.3.4 序列数据处理及系统发育的分析
•     2.2.4 统计分析
•       2.2.4.1 相对多度
•       2.2.4.2 多样性指数分析
•     2.2.5 二代高通量测序
•       2.2.5.1 宏基因组DNA提取
•       2.2.5.2 PCR扩增及测序
•       2.2.5.3 数据处理
•     2.2.6 高效降解角蛋白真菌产酶条件的研究
•       2.2.6.1 孢子悬浮液的制备
•       2.2.6.2 粗酶液的制备
•       2.2.6.3 酶活力的测定
•       2.2.6.4 高效角蛋白降解菌液体发酵产酶的单因素优化
•       2.2.6.5 正交试验
• 3 结果与分析
•   3.1 添加富角蛋白基质土样中可培养真菌群落多样性分析
•     3.1.1 加入鸡毛粉不同时期医院绿地土真菌的群落组成差异
•     3.1.2 加入鸡毛粉不同时期医院绿地土真菌群落组成的多样性差异
•     3.1.3 富角蛋白的基质对病原真菌类群相对丰度的影响
•     3.1.4 小结
•   3.2 基于高通量测序对添加富角蛋白基质土样中不同时期真菌群落组成的动态变化
•     3.2.1 加入鸡毛粉后医院绿地土壤相对丰度及群落组成发生明显变化
•     3.2.2 加入鸡毛粉后医院绿地土中一些潜在人体病原真菌的动态变化
•     3.2.3 鸡毛粉加入后医院绿地土真菌群落组成的α-多样性差异
•     3.2.4 富角蛋白基质对病原真菌类群相对丰度的影响
•     3.2.5 小结
•   3.3 高效降解角蛋白真菌的鉴定及其产酶培养组分的优化
•     3.3.1 高效角蛋白降解真菌的鉴定
•       3.3.1.1 形态描述
•       3.3.1.2 分子鉴定
•     3.3.2 高效角蛋白降解菌液体发酵产酶的单因素优化
•       3.3.2.1 不同C源培养基对菌株1Y2-12产角蛋白酶活力的影响
•       3.2.2.2 不同N源培养基对菌株1Y2-12产角蛋白酶活力的影响
•       3.2.2.3 不同无机离子源培养基对菌株1Y2-12产角蛋白酶活力的影响
•     3.3.3 正交试验结果
• 4 讨论
•   4.1 添加富角蛋白基质土样中可培养真菌群落多样性分析
•   4.2 基于高通量测序对添加富角蛋白基质土样中不同时期真菌群落组成的动态变化
•   4.3 高效降解角蛋白真菌的鉴定及其产酶培养组分的优化
• 5 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 创新点
•   5.3 展望
• 主要参考文献
• 致谢
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 沈鑫

导师: 韩燕峰

关键词: 真菌群落,动态变化,角蛋白,真菌降解,病原真菌

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,农业科技

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用,农业基础科学

单位: 贵州大学

分类号: X713;X172

总页数: 68

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