东北酸菜发酵过程亚硝酸盐微生物酶降解机制及应用

论文摘要

蔬果类发酵腌制食品可以通过微生物主导的亚硝酸盐酶降解和酸降解两种途径降低亚硝酸盐浓度。酸降解的研究较为透彻,广泛应用于发酵食品乳酸菌直投生产中。然而,酸降解不能消除过量农业氮肥施用造成的蔬果内高浓度的硝酸盐。这些硝酸盐进行人体后可被栖息于中性肠道的微生物还原,形成二次亚硝酸盐危害。因此,蔬果发酵腌制过程中,硝酸盐和亚硝酸盐的微生物酶降解机制的解析和应用具有重要意义。本论文以东北酸菜为对象进行发酵腌制模拟实验,参考氮素的生物化学地球循环途径和特征,通过对东北酸菜固体和发酵液液体理化性质、微生物转化氮素的功能基因丰度和细菌群落结构多样性的动态监测,明确东北酸菜腌制过程中亚硝酸盐酶降解的微生物途径和类群。同时,参考发酵液中酶降解底物的类型设计相应微生物特异性培养基分离具有酶降解功能的微生物菌株。最后进行多菌株的复合直投的初步试验。主要研究内容如下:（1）东北酸菜发酵过程亚硝酸盐酶降解途径研究。实验室模拟东北酸菜发酵条件进行了37天的连续动态监测。通过东北酸菜发酵液pH的动态监测将亚硝酸盐降解过程分为以酶降解为主的阶段（1-15天）和以酸降解为主的阶段（17-37天）。采用显色法、离子色谱法检测发酵液中氮素化合物（铵盐、亚硝酸盐与硝酸盐）浓度的动态变化。在酶降解阶段,亚硝酸盐浓度先逐渐升高,并在7天达到超过国标的峰值31.29mg/kg,然后下降至0.42 mg/kg。同时,检测到整个发酵过程中铵盐浓度变化较小且浓度远低于同时期的亚硝酸盐浓度,推测东北酸菜发酵过程中亚硝酸盐酶降解来源于微生物的反硝化作用。基于反硝化功能基因nir的实时荧光定量PCR检测,验证了上述结果同时明确了具有nirSC1基因型、nirKC5基因型与nirKC2基因型的微生物类群在东北酸菜酶降解过程中发挥了重要作用。通过高效液相法测定反硝化作用底物有机酸结果表明,酸菜发酵前期反硝化微生物类群最可能利用的碳源包括草酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸、丙酸、酒石酸、乳酸8种。（2）东北酸菜发酵过程中亚硝酸盐酶降解微生物类群解析。通过构建东北酸菜不同时期发酵液样品的高通量测序文库,对发酵过程细菌群落结构多样性进行了解析。基于细菌OTU的文库稀释曲线、Chao1指数、Shannon指数、群落结构PCoA分析和物种注释等结果均表明东北酸菜发酵过程中,细菌群落结构发生明显演替过程。在亚硝酸盐酶降解阶段,假单胞菌目（Pseudomonadales）的假单胞菌属（Pseudomonas）,乳杆菌目（Lactobacillales）的明串珠菌属（Leuconostoc）和魏斯氏属（weissella）,以及肠杆菌目（Enterobacteriales）未知新种细菌最为优势,且这些优势细菌类群相对丰度伴随发酵液中硝酸盐和亚硝酸盐浓度的动态变化而改变,是东北酸菜发酵前期亚硝酸盐酶降解阶段关键微生物类群。（3）硝酸盐和亚硝酸盐酶降解微生物分离和鉴定。以硝酸盐和亚硝酸盐作为氮源底物,以上述8种有机酸混合作为碳源电子供体,以有氧和无氧为限制条件,培养分离得到发酵液中具有同时降解硝酸盐与亚硝酸盐能力的细菌菌株133株。经过反硝化能力检测确定来自肠杆菌目（Enterobacteriales）的肠杆菌属Enterobacter、金黄杆菌Chryseobacterium、劳特菌属Raoultella和欧文氏属Kluyvera,乳杆菌目（Lactobacillales）的肠球菌属和明串珠菌属的细菌菌株,具有同时降解硝酸盐和亚硝酸盐能力。另获得2株肠杆菌属和1株金黄杆菌属的新种菌株。（4）双重还原功能菌株的直投发酵应用。从安全性出发选择明串珠菌菌株Leuconostoc citreum FXLB-3S2和肠球菌Enterococcus casseliflavus NXBC-1S2作为同时具有硝酸盐和亚硝酸盐酶降解能力的菌株。辅助分离得到的乳杆菌Lactobacillus plantarum PXLB-1S1进行单菌直投与复合直投发酵实验。直投结果表明复合发酵可将东北酸菜固体硝酸盐降解率由75%提高至84%,液体中硝酸盐降解率可达48%,且发酵过程中无亚硝酸盐积累。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 发酵腌制食品—东北酸菜亚硝酸盐降解研究现状
•     1.1.1 东北酸菜制备过程中亚硝酸盐来源
•     1.1.2 东北酸菜亚硝酸盐降解途径——酸降解与酶降解
•   1.2 亚硝酸盐相关的微生物氮素循环
•     1.2.1 反硝化作用相关微生物及其关键功能酶基因
•     1.2.2 硝化作用相关微生物及其关键功能酶基因
•     1.2.3 硝酸盐氨化作用相关微生物及其关键功能酶基因
•     1.2.4 厌氧氨氧化作用相关微生物及其关键功能酶基因
•   1.3 亚硝酸盐降解微生物研究方法
•     1.3.1 免培养方法
•     1.3.2 培养方法
•   1.4 立题依据与意义
•   1.5 研究内容
• 第二章 东北酸菜发酵过程亚硝酸盐微生物降解途径研究
•   2.1 引言
•   2.2 材料试剂与仪器设备
•     2.2.1 材料与试剂
•     2.2.2 仪器与设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 酸菜发酵液中亚硝酸盐的测定
•     2.3.2 发酵液与白菜固体中硝酸盐的检测
•     2.3.3 酸菜发酵液中铵盐的检测
•     2.3.4 酸菜发酵液中有机酸含量测定
•     2.3.5 酸菜发酵液中亚硝酸盐代谢微生物功能基因的动态监测
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 东北酸菜发酵过程氮素化合物理化性质动态
•     2.4.2 东北酸菜发酵过程亚硝酸盐代谢功能基因动态变化
•     2.4.3 东北酸菜发酵过程亚硝酸盐酶降解微生物可利用碳源类型检测
•   2.5 讨论
•   2.6 本章小结
• 第三章 东北酸菜发酵过程亚硝酸盐降解微生物类群解析
•   3.1 引言
•   3.2 材料试剂与仪器设备
•     3.2.1 材料与试剂
•     3.2.2 仪器与设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 样品处理
•     3.3.2 酸菜发酵液样品总DNA提取
•     3.3.3 测序与数据处理
•   3.4 结果与分析
•     3.4.1 东北酸菜发酵液高通量文库建立
•     3.4.2 东北酸菜发酵液微生物群落多样性解析
•     3.4.3 东北酸菜发酵液微生物物种注释
•   3.5 讨论
•   3.6 本章小结
• 第四章 亚硝酸盐酶降解反硝化微生物分离、鉴定和应用
•   4.1 引言
•   4.2 材料试剂与仪器设备
•     4.2.1 材料与试剂
•     4.2.2 实验仪器与设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 菌种分离与鉴定
•     4.3.2 菌株反硝化功能性验证
•     4.3.3 硝酸盐与亚硝酸盐降解菌株直投应用
•   4.4 结果与分析
•     4.4.1 菌株分离鉴定结果
•     4.4.2 菌株反硝化能力测定结果
•     4.4.3 分离菌株直投应用结果分析
•   4.5 讨论
•   4.6 本章小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读学位期间发表论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高凤

导师: 朱琳

关键词: 硝酸盐,亚硝酸盐,酶降解,反硝化微生物,直投发酵

来源: 江苏大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业,轻工业手工业

单位: 江苏大学

分类号: TS255.53;TS201.3

总页数: 84

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