人胚胎干细胞向多巴胺前体细胞的分化研究

论文摘要

人口老龄化会面临各种退行性疾病的高发。其中,神经系统的退行性疾病占有很大的比例。本课题主要围绕帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的细胞疗法展开研究,为之后研究中脑DA神经元的发育路径,PD发病机制和开展PD的细胞疗法奠定了坚实的基础。PD的发病机制主要是中脑黑质（substantia nigra pars compacta,SNc）区域DA神经元的死亡导致多巴胺（dopamine,DA）分泌量减少。开展PD的细胞治疗,最重要的是要得到源源不断的供体细胞,即DA神经前体细胞。本课题主要研究目标是建立DA神经元的分化体系,为PD的细胞疗法提供细胞。采用的策略是将人胚胎干细胞（human Embryonic Stem Cells,hESCs）定向分化为DA前体细胞从而得到供体细胞。首先,通过添加特定组合的因子将hESCs诱导分化为神经底板细胞（neural floor plate cells,NFP）,这部分细胞能够表达神经底板细胞的标志物LMX1A,FOXA2,OTX2。然后,经过FGF8等因子的诱导,神经底板细胞能够分化为DA前体细胞,这些细胞能够表达中脑的标志物LMX1A,FOXA2,EN1。我们将其体外培养发成熟为多巴胺神经元后,它能够表达成熟DA神经元的标志物TH,TUJ1。为了探究不同hESCs的分化潜力是否存在差异,我们采用了12株hESCs进行了DA的分化。实验结果证明,不同hESCs分化产生的DA神经前体细胞的效率是不同的,并筛选出了一株DA分化潜力较高hESCs,为DA的分化提供种子细胞。目前建立的DA神经元的化体系仍有不足之处。第一个不足之处是:DA前体细胞的标志物LMX1A的表达比例过低。通过查阅文献发现LMX1A在发育上是由WNT通路调控的,而CHIR99021是WNT通路的激活剂,所以我们利用了H9-LMX1A的报告细胞系对CHIR99021的最适浓度进行了筛选,进而上调LMX1A的表达水平。第二个不足之处是试剂不符合临床要求。由于基础级B27中含有BSA成分,我们更换为临床级B27。实验结果证明临床级B27可以较好的取代基础级B27。第三个不足之处是DA神经元的分化效率较低。本课题使用两种方法来提高DA神经元的分化效率。一种提高效率的方法是通过延长两种营养因子GDNF和TGFβ3的作用时间来为DA神经元提供分化所需的营养物质,进而提高LMX1A,FOXA2,EN1,TH,TUJ1的表达比例。另一种方法是在ES细胞诱导分化为神经细胞的过程中,通过降低高SHH的浓度,同时加入SHH的激活剂PP来增强腹侧化程度来提高DA神经元的分化效率。从分化成本上看,SHH是一种蛋白质,价格较贵,这样也可以减少DA神经元的分化的成本,这为后续大量提供DA细胞治疗PD提供了很大的帮助。综上所述,本课题主要包括三个部分:DA神经元分化体系的建立,不同hESCs向DA分化潜力的差异性研究,DA神经元分化体系的优化。这不仅为PD的细胞治疗提供了充足的供体细胞,还为DA分化体系的优化提供了宝贵经验。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第1章 绪论
•   1.1 疾病简介
•   1.2 发病机制
•   1.3 疾病进程
•   1.4 致病因素
•   1.5 常规治疗
•   1.6 细胞治疗
• 第2章 材料与方法
•   2.1 hESCs的培养
•     2.1.1 实验材料、仪器与试剂
•     2.1.2 实验方法
•   2.2 DA前体细胞的分化
•     2.2.1 实验试剂、仪器与耗材
•     2.2.2 实验方法
•   2.3 免疫荧光鉴定
•     2.3.1 实验试剂、仪器及耗材
•     2.3.2 实验方法
•   2.4 流式细胞鉴定
•     2.4.1 实验试剂、仪器与耗材
•     2.4.2 实验方法（报告细胞系的流式鉴定）
• 第3章 结果
•   3.1 人胚胎干细胞的培养
•   3.2 人胚胎干细胞向中脑区域多巴胺神经前体细胞的定向分化
•   3.3 不同细胞系分化差异的研究
•   3.4 DA分化体系的优化
•     3.4.1 优化WNT信号浓度,提高LMX1A的表达比例
•     3.4.2 将基础级B27 更换为临床级B27,避免动物源性成分的混入
•     3.4.3 改变因子的加入时程,提高DA神经元的分化效率
•     3.4.4 使用SHH激活剂PP可以高效诱导人ES分化成为腹侧底板细胞
• 第4章 讨论
• 第5章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 在读期间发表的论文及研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 冯琳

导师: 杨月伟,李伟

关键词: 帕金森病,多巴胺,人胚胎干细胞,神经底板细胞,多巴胺神经前体细胞,多巴胺能神经元

来源: 曲阜师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 曲阜师范大学

分类号: R329.2

总页数: 49

文件大小: 3722K

下载量: 44