王秋华1聂昌君1罗世强1朱柳静2唐宁1
1.柳州市妇幼保健院医学遗传科，柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室
2.柳州市妇幼保健院乳腺专科广西柳州545001
基金项目：Z2013600
[摘要]目的：探讨乳腺癌易感基因在乳腺增生个体中的拷贝数变异。方法：应用多重连接依赖式探针扩增（Multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）技术检测86例乳腺增生患者BRCA2和CHEK2基因拷贝数变异。结果：在86例乳腺增生患者中，发现1例CHEK2基因可疑缺失，而BRCA2基因未发现拷贝数变异。结论：BRCA2和CHEK2基因拷贝数变异不是乳腺良性增生的重要原因。。
[关键词]乳腺增生；多重连接依赖式探针扩增（MLPA）；BRCA2；CHEK2
乳腺增生症的发病率占育龄妇女的80%~90%，占全部乳腺疾病的75%，是育龄妇女最常见的乳腺病，其患病率近年来呈现逐年上升的趋势[1]。大量研究表明乳腺良性疾病是乳腺癌发生的重要原因之一。乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升的趋势，严重威胁女性健康[2]。
本研究选择86例乳腺增生症患者作为研究对象，采用多重连接探针扩增技术（Multiplexligation-dependentprobeamplification）对BRCA2和CHEK2基因拷贝数测定，旨在进一步探讨乳腺癌易感基因拷贝数变异在乳腺良性增生疾病发生中的作用，为乳腺癌的预防及早期诊断提供依据。
1对象与方法
1.1研究对象
受检对象来自于2014年5月至2015年8月柳州市妇幼保健院乳腺科因乳腺增生在医院就诊的患者。所有患者均经超声和钼靶检测确诊。本研究受检对象均已签署知情同意书。
1.2基因组DNA提取及浓度分析
抽取患者静脉血2~4mL，EDTA抗凝，采用酚-氯仿法提取基因组DNA，使用紫外分光光度计测定所提取DNA在260nm和280nm处的吸光值，得出其浓度及纯度，并用TE溶液稀释至50ng/μL的终浓度。纯度要求A260/A280在1.7-2.0之间。
1.3多重连接依赖的探针扩增（MLPA）分析
本研究采用荷兰MRC公司研发的SALSAMLPAP045CHD试剂盒，共44条探针，33条探针位于BRCA2基因（外显子1~23）及其上下游区域，3条探针位于分别位于CHEK2基因外显子10、1100delC突变位点及其下游区域。5q31、4q35、12q23、2q13、12q13、11q22、11q12和2q32各一条探针作为对照。
1.3.1多重探针杂交
取待测样本DNA150ng置于PCR管中，加TE至总体积为5μL，于9700基因扩增仪（9700型，美国ABI公司）上98℃变性5min，快速降温，25℃保持。取出PCR管后加入多重探针及MLPA缓冲液各1.5μL，充分混匀后，95℃变性1min，60℃杂交16～20h，54℃维持。
1.3.2多重探针连接反应
在上述PCR管内加入连接酶-3111μL和连接酶缓冲液A、B各3μL，及H2O25μL配成的连接混合液32μL，54℃反应15min，然后98℃5min灭活连接酶-311，20℃维持。
1.3.3多重PCR反应
在上述连接产物中，加入PCR引物及相应缓冲液混合液2μL、聚合酶0.5μL、H2O7.5μL配制成的混合液10μL，总反应体系50μL，进行PCR扩增。扩增条件为95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸20min，15℃维持。每一批反应均有两个正常样本作为对照（HumanGenomicDNA，美国Promega公司）。
1.3.4MLPA产物分析和结果判读
利用遗传分析仪（3500Dx型，美国ABI公司）对多重PCR扩增产物进行毛细管电泳和数据采集，用GeneMapper3.7软件（美国ABI公司）获得各探针位点峰高和峰面积。所采集的数据通过Coffalyser.Net专用软件（荷兰MRC公司）进行分析，得出基因相对拷贝数比值（Ratio值）。根据试剂盒说明书，以Ratio值在0.7~1.3之间判定为正常，Ratio值<0.7为存在基因缺失，Ratio值>1.3为存在基因重复。
2结果
2.186例乳腺增生患者MLPA分析结果
在86例乳腺增生中，共检出1例为CHEK2基因可疑缺失，可疑阳性率为1.16%（1/86）。可疑阳性样本均由两个研究者进行了2次重复检测，所得结果一致。BRCA2基因未发现拷贝数变异。MLPA阳性病例的基因相对拷贝数比值（Ratio比值）见（表1）。部分阳性病例的毛细管电泳图谱见图1。
表1MLPA可疑阳性病例的基因相对拷贝数比值（Ratio比值）
基因区域染色体位置Ratio比值
CHEK2-1022q12.10.69
HSCB-222q12.10.68
注：Ratio值<0.7者表示基因缺失，连续基因缺失则为片段缺失；Ratio值>1.3表示基因重复，连续基因重复则为片段重复。
图1可疑阳性样本的毛细管电泳标准化后的柱形图
横坐标下方表示检测位点，横坐标上方表示探针所在基因位置及探针长度；纵坐标表示基因相对拷贝数比值（Ratio比值）。A：正常对照样本的毛细管电泳标准化后的柱形图；B：可疑阳性样本毛细管电泳标准化后的柱形图，结果显示CHEK2基因可疑缺失(见红色方框部分)。
3讨论
乳腺增生是临床上常见的一种乳腺疾病，以乳房肿块、乳痛和乳头溢液为主要症状，主要是由于内分泌激素失调所引起，以中年妇女多见。乳腺增生是指乳腺上皮和纤维组织增生、乳腺导管和乳小叶在结构上的退行性病变及进行性结缔组织的生长。依据病理特征乳腺增生可以分为单纯性乳腺上皮增生症、乳腺囊性增生症及乳腺腺病。乳腺增生发病率比较高，占全部乳腺疾病的70％以上，并且其患病率呈现逐年上升的趋势。
研究表明乳腺增生与乳腺癌的发生密切相关，即正常→增生→非典型增生→原位癌→浸润癌的发展过程。慕秋霞等[2]对180例已确诊的乳腺增生患者临床随诊，半年至一年后复查，结果发现4例重症乳腺增生患者转变为乳腺癌，并且认为乳腺增生是否发展为乳腺癌,取决于导管和乳腺上皮增生的程度和有无非典型性增生。王桂玲等[3]对150例确诊为乳腺增生患者的临床资料进行回顾性分析，同样也发现乳腺增生转变为乳腺癌的主要诱因是导管和乳腺上皮增生及非典型性增生。乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，严重危害着广大女性的生命和生活，同时也造成了社会经济和病人家庭的沉重负担加重。乳腺癌的发生发展涉及多种基因，其易感基因研究对肿瘤风险评估、早期诊断和个性化用药指导等具有重要作用。BRCA2和CHEK2是已经证实了的重要的乳腺癌易感基因，在乳腺癌的发生过程中发挥了重要的作用。乳腺癌易感基因的变异虽然以DNA点突变为主，但也可以发生基因组大片段的缺失和重复。
目前对大基因组重排突变的检测方法有荧光原位杂交杂交、实时定量PCR、比较基因组杂交以及多重连接依赖的探针扩增法等。前三种方法对实验技术要求高并且价格昂贵。MLPA方法是近几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术，它应用针对特异探针和一对通用引物，通过一个连接反应和PCR反应扩增所有目的片段，然后再进行毛细管电泳分析，连接反应具有高度的特异，只有当两个探针与靶序列完全完全互补时，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行[4,5]。本研究采用的MLPA试剂盒P045覆盖了BRCA2基因的23个外显子和CHEK2基因的2个外显子，共发现1例CHEK2基因可疑缺失，而BRCA2基因未发现拷贝数变异。证明这一试剂盒是乳腺癌易感基因检测可靠的方法，
本研究发现1例CHEK2基因可疑缺失，CHEK2基因是一个重要的抑癌基因，它编码CHEK2激酶，CHEK2激酶是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，活化后可以磷酸化并且稳定多种蛋白，从而导致细胞周期阻滞。CHEK2的异常会导致细胞周期检测点对DNA损伤或者复制阻滞不能正常发挥功能，进而导致癌变[6,7]。CHEK2是继BRCA1/2后发现的另一个重要的乳腺癌易感基因。本研究发现这例CHEK2基因可疑缺失，它的外显子10及其下游连锁的基因均存在可疑缺失，下一步需要设计荧光原位杂交探针进一步证实。可疑缺失的发现也提示我们在对高危乳腺癌患者进行遗传基因检测时，除了常规的点突变，还应该进行基因拷贝数筛查。
参考文献
[1]白淑，何涛，白鸿，等.乳腺增生病的研究概况[J].中国疗养医学,2015(01):26-29.
[2]慕秋霞.乳腺增生与乳腺癌关系的研究[J].实用医技杂志,2008(01):92-93.
[3]王桂玲，任连成，刘春香.乳腺增生与乳腺癌相关性研究[J].中国医药导刊,2014(06):972-973.
[4]魏惠平，伍治平，谢建生，等.多重连接依赖式探针扩增技术及其在医学上的应用[J].中国实用医药,2009(12):1-3.
[5]胡晓，李汶，卢光琇.多重连接依赖性探针扩增技术及其应用进展[J].现代生物医学进展,2010(02):362-365.
[6]王宁，王雅杰.细胞周期激酶CHEK2和p53在恶性肿瘤细胞周期和凋亡中的作用[J].医学研究杂志,2012(09):4-6.
[7]王宁，王雅杰.细胞周期激酶CHEK2在早发性乳腺癌遗传易感性中的作用[J].医学研究杂志,2011(10):5-8.