cxcr2基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定

论文摘要

目的构建小鼠CXC型趋化因子受体2（CXCR2）基因cxcr2过表达的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mes-enchymal stem cell,BMSC）并进行鉴定。方法全骨髓贴壁法分离培养小鼠BMSC,采用流式细胞术检测干细胞抗原1（stem cell antigen-1,SCA-1）、CD44、CD43、CD45、IA/IE表达率,并诱导成骨分化。以含有小鼠cxcr2的质粒为模版进行PCR扩增,将获得的cxcr2克隆到慢病毒载体,命名为p Lenti-cxcr2-GZ;将其与慢病毒包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒后,通过离心法感染BMSC,经过1μg/mL zeocin压力选择建立了稳定表达CXCR2的小鼠BMSC（CXCR2-BMSC）。采用流式细胞术和RT-PCR分别检测其CXCR2蛋白和m RNA表达水平,Transwell趋化实验检测其迁移能力。结果 90%以上的第3代BMSC表达CD44、SCA-1,几乎不表达IA/IE、CD34、CD45,且成功诱导成骨分化。菌液PCR、质粒双酶切后,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果得到特异、大小正确的条带及测序鉴定正确,表明成功构建了p Lenti-cxcr2-GZ表达质粒。流式细胞术和RT-PCR结果显示,CXCR2-BMSC的CXCR2蛋白和m RNA表达水平均明显高于对照组BMSC,差异有统计学意义（P<0.001）。Transwell结果显示,CXCR2-BMSC迁移能力高于对照组BMSC,差异有统计学意义（P<0.01）。结论利用慢病毒系统成功构建了稳定表达CXCR2的BM-SC,cxcr2基因修饰BMSC后可明显增加BMSC的迁移能力。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 细胞与质粒
•   1.2 实验动物
•   1.3 主要试剂及仪器
•   1.4 BMSC的分离、鉴定
•   1.5 cxcr2过表达的慢病毒载体构建及慢病毒包装
•     1.5.1 cxcr2基因片段的制备
•     1.5.2 重组质粒pLenti-cxcr2-GZ的构建及鉴定
•     1.5.3 pLenti-cxcr2-GZ慢病毒的包装
•   1.6 pLenti-cxcr2-GZ稳定转染BMSC的构建及筛选
•   1.7 稳定转染细胞系鉴定
•     1.7.1 流式细胞术检测CXCR2蛋白表达
•     1.7.2 Real-time PCR检测cxcr2 m RNA的表达
•   1.8 Transwell趋化试验
•   1.9 统计学方法
• 2 结果
•   2.1 BMSC分离及鉴定
•     2.1.1 小鼠BMSC形态
•     2.1.2 BMSC表面标志分子流式鉴定
•     2.1.3 诱导BMSC成骨分化
•   2.2 cxcr2慢病毒载体的构建
•   2.3 p Lenti-cxcr2-GZ稳定转染BMSC的构建及筛选
•   2.4 稳定转染细胞系鉴定
•   2.5 cxcr2基因修饰的BMSC迁移能力增强
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 张莉,刘永飞,叶传涛,边培育,雷迎峰,侯立朝

关键词: 型趋化因子受体,小鼠,骨髓间充质干细胞,细胞迁移

来源: 微生物学免疫学进展 2019年01期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,基础医学

单位: 空军军医大学西京医院麻醉与围术期医学科,空军军医大学唐都医院麻醉科,空军军医大学唐都医院传染科,空军军医大学微生物学教研室

基金: 国家自然科学基金项目(81871697)

分类号: R329.2

DOI: 10.13309/j.cnki.pmi.2019.01.004

页码: 19-25

总页数: 7

文件大小: 1140K

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