一、新一代ECM公司:New Interwoven（论文文献综述）
梁贞[1]（2021）在《基于微服务架构和国密算法的高速公路收费认证平台设计》文中指出联网密钥管理及安全认证系统是全国高速公路联网收费平台的核心组成部分。现行系统始建于2006年,运行至今,系统的技术架构和功能设计已无法满足“撤消省界站”新收费模式下的国产密码算法迁移、设备在线发行、在线充值、在线交易、智慧高速车联网等新业务需求,迫切需要进行技术重构、功能拓展、密码算法迁移。为此,本文研究基于支持异构开发、单业务升级和高并发集群部署的微服务框架和国密算法的高速公路联网收费认证平台的设计与实现。本文首先分析高速公路联网收费认证平台的功能性、非功能性和接口需求,给出该平台的密钥管理、证书申请、发行认证、充值认证和交易认证五大功能模块结构,依据微服务架构思想阐述了密钥管理、证书管理、发行认证、充值认证和交易认证五个子服务系统的处理逻辑,设计优化认证平台的证书申请和下载、身份认证、设备激活和交易认证4个关键算法,设计了密钥管理数据表结构、证书管理数据表结构、发行认证数据表结构、充值认证数据表结构、交易认证数据表结构,提出了密钥管理模块、证书管理模块、发行认证模块、充值认证模块和交易认证模块的实现方法。在上述工作基础上,基于微服务架构的Spring Boot框架技术、Linux和Windows操作系统、Oracle数据库管理系统、Intelli J IDEA、Rabbit MQ、国密算法和密码机,采用C#和JAVA编程,开发实现了高速公路联网收费认证平台,并进行实验测试。测试结果表明,该平台解决了新增业务的功能需求,并提高了高速公路收费系统的并发处理性能、安全性和可维护性。本文开发的高速公路联网收费认证平台支持子服务系统单独升级发布,可自动化部署;通过优化身份认证算法,有效降低了数据交互量,提升验证速度和验证成功率,通过批处理设备发行和证书申请,减少了交互次数,从而提高业务处理速度。该平台已应用于省级联网收费认证业务,运行效果良好。
王宝剑[2]（2021）在《基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立》文中研究表明黄韧带肥厚（Ligamentum flavum hypertrophy,LFH）是退行性腰椎管狭窄症（Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS）的主要病理表现之一。黄韧带（ligamentum flavum,LF）位于上、下椎板之间,从颈椎延伸至骶椎,起到保护和稳定脊柱的作用。黄韧带在纤维化过程中一方面是其自身体积发生增厚的改变,另一方面是其自身弹性的下降在脊柱后伸时出现皱褶、折叠,使椎管容积减小,导致马尾神经、神经根的受压和缺血缺氧。与此同时,肥厚黄韧带中增多的炎性介质会透过硬脊膜而扩撒至神经根,易造成神经根的炎症及水肿。另外,炎性介质还可以激活多种纤维化因子的表达而加速纤维化的进程。因此黄韧带炎症与纤维化的病理改变共同参与、相互影响而导致了 DLSS腰腿痛、间歇性跛行的症状。在退行性脊柱疾病的促炎细胞因子中,IL-1β、TNF-α是最主要的参与者,其在肥厚黄韧带中的高表达已得到初步证实,另外TGF-β 1/Smads被认为是引起纤维化的最重要的信号传导通路,它在各种组织与器官的纤维化和瘢痕组织纤维性修复过程中有着核心的推动作用。但目前关于黄韧带炎性或纤维化信号通路的研究较少。至于Smads通路是否可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带的肥厚,以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路中的相关原件与黄韧带厚度、纤维化程度的具体相关性尚未见报道。而在中医机制方面,“阳化气,阴成形”理论对黄韧带肥厚的病机阐明具有重要指导作用,该理论与现代医学“炎症-纤维化”的病理机制相契合。但目前尚无从该角度探讨黄韧带肥厚的报道。黄韧带肥厚动物模型的建立是研究退行性脊柱疾病的基础,也是探索黄韧带增厚机制、发现药物潜在治疗靶点的前提。但极少数研究涉及腰椎黄韧带肥厚动物模型的制作,对于该动物模型目前仍存在争议。实验一基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性目的:通过对比增厚黄韧带与未增厚黄韧带的纤维化程度以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路相关原件的表达水平,探索黄韧带厚度与纤维化程度和以上原件表达的具体相关性,初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。从“阳化气,阴成形”理论角度阐述黄韧带肥厚的中医病机,以期为中医药干预黄韧带“炎症-纤维化”病理过程提供理论支持。方法:（1）在取得医学伦理批准和患者知情同意的前提下,在临床手术中收集废弃的DLSS组增厚黄韧带和腰椎间盘突出症（Lumbar disc herniation,LDH）组未增厚黄韧带,各25例。（2）通过MRI测量两组黄韧带的厚度并对比其差异。（3）对两组标本组织进行HE染色组织学观察。（4）进行Masson三色法染色后,通过纤维化分级标准以及弹性纤维-胶原纤维比值来对比两组黄韧带总体与各层（腹侧层、中间层、背侧层）纤维化程度的差异。（5）免疫组化法检测两组黄韧带IL-1β、TNF-α、TGF-β 1/Smads（TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7）、collagen Ⅰ（Col 1）、collagen Ⅲ（Col 3）的定位、半定量表达。（6）Real-Time PCR 法检测两组黄韧带 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7）、Col1 和 Col 3 mRNA 的定量表达。（7）相关性研究:通过pearson相关与线性回归分析明确DLSS组黄韧带的厚度与其各层纤维化程度、mRNA表达的具体相关性。结果:（1）DLSS 组的黄韧带厚度为 5.13±0.80mm,大于 LDH 组 3.52±0.67mm（p<0.01）。（2）HE染色下,LDH组的未增厚黄韧带弹性纤维呈直线状,排列紧密且整齐,表面光滑连续,以弹性纤维为主,含有少量胶原纤维,细胞数目较少。DLSS组增厚的黄韧带纤维呈波浪状,排列紊乱、疏松,弹性纤维减少,胶原纤维含量增加,成纤维细胞增多。（3）DLSS组的总体纤维化分级为2.44±0.31级,高于LDH组的1.62±0.22级（p<0.05）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级是逐渐递增的,即腹侧层<中间层<背侧层（p<0.05或p<0.01）;DLSS组的弹性纤维-胶原纤维面积比值为1.85±0.54,低于LDH组的2.92±0.37（p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值均低于LDH组（p<0.05或p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值是逐渐递减的,即腹侧层>中间层>背侧层（p<0.05或p<0.01）。（4）免疫组化:DLSS 组的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-Smad2/3、Col 1和Col 3的蛋白表达均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）。DLSS组的Smad7的蛋白表达低于LDH组（p<0.01）。（5）Real-Time PCR:DLSS 组 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1 和 Col 3 的 mRNA 表达高于 LDH 组（p<0.05 或 p<0.01 或 p<0.001）。DLSS 组 Smad7 的 mRNA 表达低于 LDH 组（p<0.05）;DLSS 组的 IL-1β、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3的mRNA表达在背侧层最高,腹侧层最低,有从背侧层向腹侧层逐渐递减的趋势。Smad7的mRNA表达在背侧层最低,腹侧层最高,有从背侧层向腹侧层逐渐递增的趋势。（6）在DLSS组中,黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的纤维化分级随着黄韧带的厚度的增加而升高。各层的相关系数r分别为0.54,0.73,0.84,说明黄韧带的厚度与背侧层纤维化分级的相关程度最高。黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的弹性纤维-胶原纤维比随着黄韧带的厚度的增加而降低。各层的相关系数r分别为-0.62,-0.72,-0.81,说明黄韧带的厚度与背侧层弹性-胶原纤维比值的相关程度最高。（7）在DLSS组中,黄韧带厚度与背侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为IL-1 β、Col 1等;黄韧带厚度与中间层IL-1 β mRNA表达的相关程度最高,其次依次为Smad7、TGF-β 1等;黄韧带厚度与腹侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为为IL-1 β、Col 3等。结论:（1）相较于未增厚黄韧带,肥厚黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3（或p-Smad2/3）、Col 1和Col3的mRNA和蛋白均呈高表达,Smad7的mRNA和蛋白呈低表达。初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。（2）在肥厚黄韧带中,背侧层的纤维化程度大于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的纤维化程度呈正线性相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。在肥厚黄韧带中,IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3 mRNA表达均高于中间层和腹侧层,Smad7 mRNA表达低于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的mRNA表达呈正线性（或负线性）相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。说明黄韧带炎症与纤维化的严重程度由背侧向腹侧逐渐递减,其病理改变可由背侧向腹侧逐渐发展。（3）结合“阳化气,阴成形”理论认为,黄韧带在增龄、急性创伤、慢性劳损等因素作用下易出现微损伤,并诱导了局部炎症反应,当机体处于“阴平阳秘”的生理状态时,这种损伤尚能引发适度的炎症反应,以及正常的纤维化修复和瘢痕的形成,而当机体处于阴阳失衡、阳不化气状态时,持续的炎症反应使细胞因子、趋化因子等代谢产物长期聚集于黄韧带局部,形成了炎症微环境,从而诱发了过度的纤维化修复和瘢痕的形成。该中医理论与现代医学中炎症反应诱发过度的纤维化修复和瘢痕形成的理论相类似。实验二基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价目的:建立一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,并将其与人肥厚黄韧带组织进行比较、评估。同时,探讨腰椎活动范围的增加所诱发黄韧带增厚的机制。方法:（1）将72只大鼠分为A假手术组（切开皮肤等组织后缝合）、B肌肉切除组（切除L5-L6椎旁肌肉）、C骨关节切除组（切除L5-L6棘突和棘上韧带,磨除L5/6双侧关节突关节的一半,关节囊不做缝合处理）以及D肌肉+骨关节切除组（B+C混合）共4组,于造模后的4w、8w、12w共3个时间点取材。（2）通过对黄韧带的HE染色和Masson染色,测量L5/6节段黄韧带总体和背侧层的厚度以及弹性纤维-胶原纤维的比值。（3）通过X线片测量屈曲和背伸位时L5/6节段的活动范围和椎间隙高度。（4）通过免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR法检测黄韧带中炎性因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads通路相关原件和Col 1、Col 3的表达。（5）将大鼠黄韧带与人肥厚黄韧带的退变程度进行比较、评估。结果:（1）HE染色与黄韧带厚度的测量:三种造模方法均可以引起黄韧带厚度的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的整体厚度是假手术组的1.35倍,骨关节切除组是假手术组的1.14倍,肌肉切除组是假手术组的1.06倍。但三种造模方法均不能引起黄韧带宽度的额外增加。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带背侧层厚度是假手术组的2.09倍,骨关节切除组是假手术组的1.26倍,肌肉切除组是假手术组的0.96倍。三种造模方法中只有骨关节切除法和肌肉+骨关节切除法可以引起黄韧带背侧层厚度及其所占比例的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法。（2）Masson染色与纤维化程度:三种造模方法均可以引起黄韧带的弹性-胶原纤维比值的下降,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的弹性-胶原纤维比是假手术组的0.43倍,骨关节切除组是假手术组的0.66倍,肌肉切除组是假手术组的0.95倍。（3）影像学测量:三种造模方法均可以造成屈曲位椎间隙后方高度和活动范围的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,骨关节切除法次之,最后是肌肉切除法。（4）免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR:①免疫组化结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-smad2/3、Col 1 和 Col 3的蛋白表达量最多,Smad7的表达量最少,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;②免疫印迹结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1和Col 1的蛋白表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;③Real-Time PCR结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col1和Col 3的mRNA表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。（5）造模术后12w时假手术组的弹性-胶原纤维的比值为2.79,将其与实验一中数据比较,其退变程度类似于人未增厚的黄韧带（2.92）;肌肉切除组的弹性-胶原纤维的比值为2.65,退变程度仍接近人未增厚的黄韧带（2.92）;骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.84,退变程度接近人轻度肥厚的黄韧带（1.66-2.23）;肌肉+骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.19,退变程度与人中度肥厚的黄韧带相近（1.08-1.66）。结论:（1）建立了一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,其退变程度可能类似于人类中度肥厚的黄韧带。（2）三种造模方法均能引起黄韧带退变与增厚,其程度依次为肌肉+骨关节切除法>骨关节切除法>肌肉切除法。（3）在大鼠模型中,黄韧带背侧层的增厚占比例最高,这可能是由于背侧层在屈曲位受到更大的应力导致的。说明机械应力可能是诱发或加速黄韧带增厚的重要因素。（4）腰椎屈曲范围的增加所引发的机械应力可导致黄韧带中炎性因子TNF-α、IL-1 β的高表达,并诱导TGF-β 1/Smads通路致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。
方悠然[3]（2021）在《CGF对共培养人骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞促成骨成血管作用及相关机制研究》文中研究说明目的:通过体外细胞共培养实验,研究浓缩生长因子（concentrated growth factors,CGF）对共培养人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,h BMSC）和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖以及成骨成血管分化能力的影响,并对CGF促共培养细胞成骨作用的机制进行初步探索。方法:（1）抽取健康志愿者血液制备富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）、富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）、CGF,通过酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测不同富血小板衍生物中主要生长因子血小板源性生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB）、转化生长因子-β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的浓度。（2）通过流式细胞术检测h BMSC表面特征性标志;在诱导h BMSC成骨、成脂分化后,通过染色检测其成骨、成脂分化能力。（3）利用流式细胞术检测2%、5%、10%、20%CGF对共培养h BMSC和HUVEC细胞增殖的影响。（4）利用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色以及实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测2%、5%、10%、20%CGF对直接共培养h BMSC和HUVEC成骨相关基因（ALP、OCN、COL-1、RUNX2）,成血管相关基因（CD31、ANG2、v WF、KDR、VEGF）以及CX43基因的表达。并通过免疫荧光染色验证了h BMSC和HUVEC间连接蛋白43（connexin 43,CX43）的存在。（5）通过Transwell小室间接共培养h BMSC和HUVEC,分析直接、间接共培养条件下成骨以及CX43基因的差异。（6）使用TGF-β1通路抑制剂阻断TGF-β1信号通道,使用外源性重组TGF-β1生长因子作用于直接共培养h BMSC和HUVEC,利用q RT-PCR检测共培养h BMSC和HUVEC成骨分化程度,探索CGF中的TGF-β1在直接共培养h BMSC和HUVEC成骨分化中的作用。结果:（1）成功获得PRP、PRF、CGF。通过ELISA检测到CGF中含有更多的PDGF-BB、TGF-β1、VEGF。（2）所购h BMSC形态特征符合骨髓间充质干细胞形态特征,具有良好的成骨、成脂分化能力,流式细胞术检测到细胞表面CD44阳性、CD105阳性、CD45、CD31阴性,可用于后续实验。（3）hBMSC和HUVEC以1:2比例直接共培养时,细胞培养第7、10、14天两者细胞数量均大致一致。当h BMSC和HUVEC以1:2比例直接共培养第7天时,在不同浓度CGF作用下,h BMSC数量随CGF浓度增高而增多。在低于5%CGF浓度条件下,HUVEC数量随着CGF浓度的增加而增多,而相对于不含CGF直接共培养组中的HUVEC,高于5%CGF浓度条件下,HUVEC增殖水平随着CGF浓度的增加而降低。（4）在10%CGF作用下,直接共培养h BMSC和HUVEC的ALP染色最明显。10%CGF直接共培养组的成骨相关基因ALP、COL-1、RUNX2、OCN的表达以及CX43的表达均高于不含CGF的直接共培养组,差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光染色显示h BMSC间、HUVEC间以及h BMSC和HUVEC细胞间有CX43蛋白表达。不同浓度CGF直接共培养组的CD31、v WF、KDR的表达与不含CGF直接共培养组相比差异无统计学意义。（5）10%CGF直接共培养组和不含CGF直接共培养组的ALP表达均显着高于10%CGF间接共培养组和不含CGF的间接共培养组,差异具有统计学意义（P<0.05）。10%CGF直接共培养组和不含CGF直接共培养组的OPG、OCN以及CX43基因表达上调较10%CGF间接共培养组和不含CGF间接共培养组更为明显。无论直接共培养,还是间接共培养,相对于不含CGF组来说,10%CGF均能够促进ALP、OPG、OCN以及CX43基因表达的上调。10%CGF作用下的直接共培养组ALP、OPG、OCN以及CX43的表达最高。（6）使用TGF-β1抑制剂后,10%CGF直接共培养组的ALP、OPG、OCN以及CX43基因的表达均下调,且下调后的表达水平与无CGF作用的直接共培养组相近。含有外源性TGF-β1直接共培养组的ALP、OCN的表达高于10%CGF直接共培养组,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:hBMSC与HUVEC直接共培养改变了CGF对单细胞培养的h BMSC和HUVEC细胞生物学行为的影响。10%CGF对与HUVEC直接共培养的h BMSC有着明显的促成骨分化作用。直接共培养h BMSC和HUVEC之间借由CX43蛋白构建的细胞间通讯可能是主要调控机制之一。CGF中主要生长因子TGF-β1可能通过细胞外旁分泌信号通道参与调控CGF对成骨的作用。
钱红运[4]（2021）在《野百合碱与缺氧诱导的肺动脉高压蛋白质组学分析》文中指出背景:肺动脉高压（Pulmonary artery hypertension,PAH）是一种严重危害人体健康的心肺疾病,其发病是一个复杂的病理生理过程,尽管目前对于肺动脉高压的研究有了很大的进展,但是其具体的发病机制仍尚未清楚。目的:探究野百合碱（Monocrotaline,MCT）和缺氧（Oxygen deficit,OD）分别诱导的肺动脉高压大鼠的肺动脉组织中差异表达蛋白以及驱动肺动脉高压潜在的信号通路和蛋白。方法:1.通过注射野百合碱和缺氧分别诱导建立大鼠肺动脉高压模型,于建模3W后通过测量大鼠的右心室收缩压（Right ventricular systolic blood pressure,RVSP）和右心室重量指数（Right ventricular mass index,RVMI）来鉴定是否建模成功。2.建模成功后分离出大鼠的肺动脉并进行蛋白提取和胰酶酶解,然后采用液相色谱-质谱联用分析和数据库检索来检测肺动脉组织中蛋白水平的变化。3.对检测到的蛋白进行筛选,然后对筛选出的差异表达蛋白进行蛋白注释、功能富集和聚类分析。4.通过蛋白注释、GO富集分析和KEGG通路富集分析筛选MCT、OD组中显着富集的信号通路。5.实时荧光定量PCR（Reverse transcription quantitative real-time,RT-qPCR）和蛋白印迹分析验证关键通路中相关蛋白的表达水平。6.采用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）对蛋白质组数据进行富集分析,并通过Cytoscape绘制蛋白互作网络并筛选中心节点蛋白质（Hub proteins,Hubs）。结果:1.对照组大鼠的RVSP为28.85±1.45,RVMI为27.28±0.6%;MCT组大鼠的RVSP为77.08±5.37,RVMI为47.75±3.1%;OD组大鼠的RVSP为64.43±4.74,RVMI为36.55±1.3%。MCT组大鼠和OD组大鼠的RVSP、RVMI都明显高于对照组大鼠的,这些结果表明我们成功的建立了MCT组大鼠和OD组大鼠的肺动脉高压模型。2.我们一共鉴定到4190个可定量的蛋白;当p<0.05时,以差异表达量变化超过1.5作为显着上调的变化阈值,小于1/1.5作为显着下调的变化阈值,我们发现在MCT vs NOR比较组中有441个蛋白表达发生上调,451个蛋白表达发生下调,在OD vs NOR比较组中有408个蛋白表达发生上调,580个蛋白表达发生下调。3.通过对差异蛋白的蛋白质组学分析,建立了多种组学表。4.通过蛋白注释、GO富集分析和KEGG通路富集分析筛选出了在MCT、OD组中都显着富集的3条信号通路,ECM-receptor interaction、fluid shear stress and atherosclerosis和chemical carcinogenesis。5.RT-qPCR和蛋白印迹分析验证了信号通路中关键基因及其相关蛋白,在mRNA水平上,除ALDH3A1外,与对照组相比MCT组肺动脉组织中VTN、FN1、THBD、THBH4表达明显上调,EXPHX1、GSTM1明显下调;在蛋白表达水平上,与对照组相比MCT组肺动脉组织中PECAM-1、SRC、GSTM1、ALDH3A1表达明显下调,THBH4表达明显上调。6.（1）GSEA富集分析提示在肺动脉高压发生过程中,由多种干扰素介导的炎症以及EMT反应等可能起促进作用,而且各种代谢途径如脂肪酸代谢、氧化磷酸化、Notch信号、胆汁酸代谢等参与了肺动脉高压的发生。（2）筛选得到了Fn1、SRC、VTN、CNN2、ITGA1、CALU、ENSRNOP00000000514、LOX、MYH11、RPS27A等10种候选的Hub蛋白。结论:1.通过蛋白质组学分析在MCT和OD诱导的PAH大鼠中发现了大量差异表达蛋白和10种候选的Hub蛋白。2.信号通路ECM-receptor interaction、fluid shear stress and atherosclerosis和chemical carcinogenesis参与到PAH发生发展。3.利用蛋白质组学研究和数据分析,有望查找PAH治疗的新潜在靶点。
陈智鑫[5]（2021）在《青少年开角型青光眼的全外显子测序分析研究》文中研究指明目的:我们前期对潮汕地区青少年开角型青光眼（Juvenile-onset primary open angle glaucoma（POAG）,JOAG）患者的全外显子测序研究显示只有很少患者带有已知的基因突变。然而,通过全基因组关联研究（Genome-wide association studies,GWAS）已确定了许多与POAG相关的基因位点。因此,我们假设JOAG患者携带POAG GWAS发现的基因突变。此研究目的是寻找中国JOAG患者中潜在的POAG相关的基因突变。方法:我们拟定了2009-2019年发表的POAG相关GWAS文章中的287个关联基因(p≤5×10-8),并在58例JOAG患者（确诊年龄11-35岁,男女比例21:8）和15例健康对照者（28-82岁,男女比例7:8）的全外显子测序结果中对287个关联基因进行罕见编码变异分析。结果:在58例JOAG患者中,我们发现了190个关联基因中662个罕见编码变异,而在15例健康对照者中,发现了91个关联基因中166个罕见编码变异。在两组结果的比对下,我们筛选出190个关联基因中564个在JOAG患者组中特有的罕见编码变异。经有害性分析软件（SIFT,Polyphen2,Mutation Taster和CADD）的预测下,我们进一步筛选出145个关联基因中310个罕见编码变异。经测序深度控制（DP>20）,我们最后筛选出116个关联基因中221个罕见编码变异。在筛查结果中,基因突变位点FLNB、TNS1、AKAP13、LRRK1和PKHD1在病人中较为广泛出现,这些基因位点及其他位点与细胞外基质、局灶粘附和Wnt信号通路功能集群较为相关。结论:我们的研究结果表明,JOAG患者携带POAG相关基因的罕见编码变异,这些POAG相关基因的罕见编码变异可能是JOAG的基因突变。JOAG的基因突变与细胞外基质、局灶粘附和Wnt信号通路功能集群较为相关,这增加对潮汕地区JOAG患者病因及潜在的分子致病机制的认识,将为日后潮汕地区JOAG患者临床诊断提供一种新的辅助风险评估手段,同时为中国和亚洲JOAG突变谱和频率提供额外的证据。
贾婷婷[6]（2021）在《Cinaciguat通过上调PKG2改善2型糖尿病大鼠种植体骨结合的作用效果及机制研究》文中研究说明背景与目的2型糖尿病（Type 2 diabetic mellitus,T2DM）是一种临床上常见的代谢性疾病,以血糖升高、血脂紊乱为主要特征,常伴有多种严重并发症,已成为损害居民健康的重大公共难题。研究指出2型糖尿病与牙周病变的发生发展密切相关,易导致患者牙齿脱落,造成牙列缺损或缺失。口腔种植技术作为现阶段修复缺失牙最理想的手段,逐渐成为众多失牙患者的首选治疗方式。2型糖尿病患者虽然有较大的种植修复需求,但由于该病会对骨代谢产生不利影响,损害成骨细胞功能,抑制种植体周围新骨再生,对种植体骨结合产生不利影响,被认为是口腔种植牙的相对禁忌症。近年来,对2型糖尿病所致种植体骨结合不良的病理机制的探索一直是科研的难点和热点之一,因此阐明其致病机制并开发有效的治疗药物将会对临床上提高2型糖尿病患者的种植义齿成功率具有重要意义。cGMP 依赖性蛋白激酶 G2（cGMP-dependent protein kinase G2,PKG2）作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶,位于真核细胞内,研究表明其能够发挥对骨骼生长的调控作用,不仅调节软骨细胞的分化,也参与调节成骨细胞功能,被认为是骨骼内稳态和骨重建的关键调节器。除此之外,cGMP/PKG2通路在维持糖代谢的稳定方面也起着重要作用,多种组织中该通路的受损被认为与糖尿病并发症的发生发展有关,而特异性激活PKG2能够有效改善这种情况。基于PKG2同时在骨代谢与糖代谢过程中起重要作用,我们推测其可能为2型糖尿病致种植体骨结合不良的关键靶点,激活其表达能够对改善糖尿病环境下成骨细胞功能障碍产生积极作用。Cinaciguat作为一种新型的药物激活剂,能够不依赖于NO直接激活被氧化的鸟苷酸环化酶,从而高效地产生cGMP,增强PKG2的活性,对于改善心脏病、肾病具有确切疗效,更被誉为治疗骨质疏松疾病最有潜力的药物。同时,cinaciguat对于糖尿病相关疾病也有较好的治疗效果,能够在糖毒性环境中对心肌细胞起保护作用,并能够增加1型糖尿病小鼠的骨小梁和密质骨。然而,cinaciguat能否作为PKG2的激活剂,缓解2型糖尿病环境下成骨细胞的功能障碍,改善种植体骨结合,及其背后的分子学作用机制尚无人报道。因此,本研究首先建立体内2型糖尿病及体外高糖高脂模型,探究PKG2的表达与2型糖尿病致种植体骨结合不良的相关性,确定其作为治疗靶点的可靠性;其次,通过慢病毒转染过表达PKG2,验证增加其表达能够改善体外糖尿病模拟环境诱导的成骨细胞功能障碍;最后探究体内外合理应用cinaciguat是否能够通过逆转糖尿病条件下PKG2的表达降低,保护成骨细胞功能,改善2型糖尿病所致的种植体骨结合不良,并通过高通量蛋白组学的方式挖掘其背后的效应分子及作用机制。本课题旨在揭示2型糖尿病影响种植体骨结合这一重要临床现象的分子基础,从而找寻出新的关键靶点PKG2及治疗药物cinaciguat来提高2型糖尿病患者种植义齿治疗的成功率。材料与方法1.2型糖尿病对大鼠种植体骨结合、成骨细胞生物学功能及PKG2表达水平的影响在体内实验中,利用喂养高脂高糖饲料联合注射低剂量链脲佐菌素的方法构建2型糖尿病大鼠模型,并实施外科手术在大鼠股骨植入人工种植体。处死大鼠后进行取材,采用Micro-CT扫描重建、硬组织切片染色、苏木素-伊红染色、改良Masson三色染色等多种手段评价2型糖尿病对于体内种植体骨结合的影响,并利用免疫组织化学染色检测PKG2在种植体周围骨区的表达情况。在体外实验中,通过酶消化乳鼠颅骨组织块的方法提取大鼠原代成骨细胞,并对分离纯化的成骨细胞进行鉴定。联合应用25mM葡萄糖和200μM棕榈酸钠模拟体外2型糖尿病高糖高脂（high-sugar and high-fat,HGHL）环境,并定义为HGHL培养基组,以正常培养基组、溶剂组作为对照组,观察各组干预下成骨细胞生物学功能的改变。主要包括利用乙炔基脱氧尿苷（5’-ethyny1-2’-deoxyuridine,EDU）荧光染色比较三组细胞的增殖能力;利用流式细胞术检测细胞的凋亡情况;采用罗丹明-鬼笔环肽荧光染色检测细胞在钛片上的黏附情况;并通过碱性磷酸酶染色及活性定量分析实验、茜素红检测矿化结节形成实验、western blot检测成骨相关蛋白的表达反映三组细胞的成骨分化能力;最后利用细胞免疫荧光及western blot检测不同组别成骨细胞内PKG2的表达情况。2.过表达PKG2对体外高糖高脂环境诱导的成骨细胞功能损伤的影响通过慢病毒转染方式使成骨细胞中PKG2过表达,并利用qRT-PCR及western blot检测过表达效率。确定PKG2能够在成骨细胞中稳定过表达后,加入HGHL培养基干预,建立HGHL+OEPKG2组,并与正常培养基组、HGHL培养基组、HGHL+OENC组（过表达对照组）进行成骨细胞生物学功能方面的比较。主要包括运用EDU荧光标记比较细胞的增殖能力;采用罗丹明-鬼笔环肽荧光染色检测细胞的黏附情况;采用碱性磷酸酶染色及活性定量分析、茜素红染色、western blot检测成骨相关蛋白表达水平反映细胞的成骨分化能力,验证过表达PKG2对体外2型糖尿病高糖高脂环境下成骨细胞功能损伤的保护效果。3.应用cinaciguat对2型糖尿病所致的成骨细胞功能障碍及种植体骨结合不良的改善作用研究在体外实验中,将cinaciguat外源性加入HGHL培养基中干预成骨细胞,并以溶剂DMSO作为对照组,通过细胞免疫荧光及western blot观察cinaciguat对于PKG2的激活作用。同时继续采用EDU荧光标记术、流式细胞术、罗丹明-鬼笔环肽荧光染色、碱性磷酸酶染色与活性定量分析、茜素红染色及western blot技术分别检测了加入cinaciguat后对于细胞增殖、凋亡、黏附及成骨分化等功能的改善效果。并利用小干扰RNA技术敲减成骨细胞内PKG2,验证cinaciguat发挥的有利作用是通过PKG2所介导。在体内实验中,构建2型糖尿病及正常大鼠种植体植入模型,并通过腹腔注射cinaciguat、皮下注射胰岛素及两者联合应用三种方法治疗糖尿病大鼠,运用钙黄绿素染色、Micro-CT重建、环境扫描电镜、硬组织切片染色、苏木素-伊红及改良Masson三色染色等多种手段评价不同治疗方法对于种植体骨结合的改善作用。4.Cinaciguat逆转2型糖尿病环境对成骨细胞损害作用的蛋白组学分析对体外HGHL培养基中加入或不加入cinaciguat干预的两组成骨细胞进行收样,且每组设立3个重复组。样本收集完毕后,进行蛋白组学检测分析,包括蛋白质的定量及质量评估、串联质谱标签标记、分级、质谱分析、数据库对比等操作。获得组学分析的蛋白表达水平的原始数据后,根据设定标准,确定两组间上下调的差异蛋白,并通过对差异蛋白进行基因本体论（gene ontology,GO）和信号通路的分析,确定蛋白的功能富集情况与参与的生物通路信息。同时构建蛋白质-蛋白质相互作用网络,预测关键蛋白PKG2与某个差异蛋白之间的潜在关系,探讨相关的效应机制。5.Cinaciguat通过PKG2改善2型糖尿病所致成骨细胞功能障碍的作用机制研究首先通过western blot验证蛋白质组学结果,确定蛋白质-蛋白质相互作用网络预测的关键蛋白PKG2与差异蛋白PLCβ1之间的相互作用;其次利用Ca2+荧光技术检测成骨细胞内钙超载的情况;再次,采用透射电镜和western blot检测内质网应激标志物的蛋白表达来评估成骨细胞的内质网应激反应;最后通过EDU荧光染色、流式细胞术、罗丹明-鬼笔环肽荧光染色、碱性磷酸酶染色与活性定量分析及western blot技术检测激活或抑制内质网应激效应对于细胞增殖、凋亡、黏附及成骨等生物学功能的影响。结果1.2型糖尿病损害大鼠种植体骨结合及成骨细胞功能,并导致PKG2表达下调体内实验成功构建2型糖尿病大鼠模型,模型大鼠的空腹血糖均高于11.1 mmol/L且稳定大于一周,完成大鼠股骨种植体植入术12周后安乐处死大鼠,收集样本,对不同组别大鼠股骨种植体的骨结合情况进行检测。Micro-CT重建分析和硬组织切片染色结果均显示与正常大鼠相比,2型糖尿病大鼠组骨结合率明显降低,骨相关的指标参数也相应下降;苏木素-伊红染色、改良Masson三色染色显示2型糖尿病大鼠种植体周围大部分为不成熟的纤维组织,骨组织较少,而正常大鼠种植体周围包绕大量成熟骨组织;免疫组织化学染色结果表明,与正常大鼠相比,糖尿病大鼠种植体周骨组织的PKG2表达明显降低。体外实验中成功分离了大鼠原代成骨细胞,并进行鉴定,其特征符合成骨细胞标准。在进行三组成骨细胞间多项生物学功能检测时,结果提示HGHL培养基能够显着降低细胞的增殖能力,且提高了细胞的凋亡比率,同时细胞在钛片上的接触面积减小,附着状态变差,成骨功能也受损严重。免疫荧光及western blot结果表明与正常组相比,HGHL组成骨细胞内PKG2表达明显降低。2.过表达PKG2改善体外高糖高脂环境诱导的成骨细胞功能损伤体外实验通过慢病毒转染成功构建了成骨细胞过表达PKG2模型,转染效率良好。对各组细胞的生物学功能进行检测时发现,过表达PKG2能够促进HGHL条件下成骨细胞增殖,改善HGHL环境下成骨细胞的黏附,同时促进HGHL培养基中细胞的成骨分化。3.应用cinaciguat能够改善2型糖尿病所致的成骨细胞功能障碍,促进种植体骨结合体外实验中细胞免疫荧光和western blot检测表明在HGHL培养基环境下外源性加入cinaciguat能够上调成骨细胞中PKG2的表达,并能够在PKG2的介导下,提升模拟糖尿病环境下成骨细胞增殖能力,抑制细胞的凋亡情况,逆转细胞的黏附不利,并能够改善成骨分化。体内实验中免疫组化染色结果提示cinaciguat能够上调2型糖尿病大鼠种植体周围骨组织中PKG2的表达;与皮下注射胰岛素或腹腔注射cinaciguat单一治疗方法相比,cinaciguat作为辅助药剂联合应用胰岛素的治疗方法能够显着改善2型糖尿病大鼠种植体骨结合不良情况,具体表现为钙黄绿素双荧光标记间距的平均距离更大、种植体骨结合率明显升高、种植体表面的骨超微结构质量更高及种植体周围的骨组织数量更多,且更为成熟。4.Cinaciguat逆转成骨细胞在2型糖尿病环境中损害作用的蛋白组学分析通过高通量蛋白组学技术比较HGHL培养基中加入或不加入cinaciguat干预的两组成骨细胞之间蛋白组分的差异,并根据p值<0.05和绝对倍数变化≥1.2两个基本原则对蛋白进行筛选,共得到221个差异蛋白。生物信息学分析结果提示差异蛋白在GO功能上主要富集在细胞外基质,在信号通路上主要富集在糖尿病的病理代谢及骨代谢等相关生物过程。更为重要的是,当以PKG2作为关键节点蛋白,进行蛋白-蛋白互作网络的分析时,我们预测出PLCβ1可能为其下游的效应蛋白。5.Cinaciguat通过PKG2抑制PLCβ1,减轻成骨细胞内钙超载和内质网应激发挥骨保护作用Western blot验证结果显示,PLCβ1蛋白的表达水平与蛋白质组学分析结果一致,且cinaciguat抑制PLCβ1的作用是通过PKG2介导的,进一步明确PKG2对于PLCβ1的调控作用。除此之外,钙离子荧光及透射电镜的结果显示cinaciguat能够通过PKG2减轻成骨细胞内由于糖尿病模拟环境下PLCβ1表达升高所引发的钙超载与内质网应激现象;而cinaciguat通过抑制内质网应激反应能够提升2型糖尿病高糖高脂环境下成骨细胞增殖能力,抑制细胞的过度凋亡,改善细胞的黏附不利,并能够促进细胞的成骨分化。结论1.2型糖尿病大鼠股骨的种植体骨结合情况较差,且高糖高脂环境下原代成骨细胞的增殖、凋亡、黏附及成骨能力受损明显。同时,在体内外模拟2型糖尿病条件下细胞中PKG2的表达均降低。2.通过慢病毒转染过表达PKG2能够改善体外2型糖尿病高糖高脂环境对成骨细胞的功能损伤,证实了PKG2在糖尿病环境下调控成骨细胞生物学行为的积极作用。3.外源性添加cinaciguat对体外2型糖尿病高糖高脂条件所造成的成骨细胞功能损伤具有保护作用,并能够作为辅助用药联合应用胰岛素显着改善2型糖尿病大鼠种植体骨结合不良情况。4.通过高通量蛋白组学技术及生物信息学分析,以PKG2作为关键节点蛋白,预测出PLCβ1可能为其下游的效应蛋白。5.Cinaciguat能够通过上调PKG2抑制PLCβ1的激活,减轻细胞内Ca2+超载-内质网应激反应,从而保护成骨细胞免受2型糖尿病的损伤,进而改善种植体骨结合。
陈芳芳[7]（2021）在《脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究》文中研究表明研究背景糖尿病是21世纪全球最严重的公共卫生问题之一,我国已成为糖尿病患者总数最多的国家。与未患糖尿病的成年人相比,大约75%的2型糖尿病患者死于心血管并发症。研究表明,冠心病合并2型糖尿病患者的冠状动脉受累程度高且弥漫病变较多、狭窄程度较重,临床治疗困难明显增加。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary interventions,PCI）是目前用于治疗冠心病合并糖尿病的有效手段。但是在PCI日臻完善的今天,糖尿病一直是PCI术中并发症和术后近、远期预后不良的独立危险因素。糖尿病患者PCI术后支架内再狭窄发生率显着升高,是严重影响患者预后的主要因素。支架内再狭窄（Int-stentrestenosis,ISR）是涉及多种机制的复杂疾病过程,是恶化2型糖尿病心血管并发症患者预后的核心问题。现有观点认为以平滑肌细胞增殖为核心的血管内膜增生是支架内再狭窄的主要病理过程和关键环节。以此为靶点开发的雷帕霉素、紫杉醇药物洗脱支架可在一定程度上降低支架内再狭窄的发生率,但存在“晚期追赶现象”,且晚期支架内再狭窄发生率仍高达10%。由此推测平滑肌细胞增殖可能只是血管内膜增生的主要中间过程而非启动因素,而糖尿病导致PCI术后支架内再狭窄发生率显着增高的关键机制也尚未阐明。因此,探索糖尿病条件下血管内膜增生的启动环节,寻找以此为靶点的干预方法,才能从源头上阻断支架内再狭窄的发生发展。对于血管结构而言,内皮细胞作为管壁组织与血液中各种病理性刺激的天然屏障,是保护平滑肌细胞免受刺激因素干扰的关键,在血管内膜增生过程中可能是先于平滑肌细胞发挥作用的核心角色。支架的植入过程中存在内皮细胞受损,内皮细胞损伤是启动动脉粥样硬化的关键步骤。围手术期药物的规范应用已在最大程度上保护了内皮细胞的完整性,而平滑肌细胞仍能不断受到刺激而增殖。近期关于内皮细胞在刺激因素下向间质细胞转变即内皮间质转化（Endothelial-Mesenchymal Transition,EndMT）的研究给了我们一定的启示。EndMT 是指在某些特定的生理或病理条件下,内皮细胞失去其自身特异性抗原,而获得间质细胞抗原,同时其生物学特性明显改变,获得较强的增殖、迁移、收缩能力。EndMT在冠状动脉和肺动脉的发育过程中可使内皮细胞向平滑肌细胞进行转化,对心血管系统的正常发育有至关重要的作用。EndMT参与了诸多与血管内膜增生相关疾病的发生过程,促进动脉粥样硬化,但未涉及PCI术后再狭窄防治的研究。因此,EndMT可能是支架内再狭窄发生的关键步骤。近来研究证实,多种外界刺激因素在内皮细胞发生EndMT中起重要作用,包括高糖、炎症、低氧、脂代谢异常、氧化应激、机械牵张力、吸烟等,但是糖尿病、动脉粥样硬化及支架内再狭窄的发病机制复杂,涉及上述多种机制的协同作用。外泌体（Exosomes）能够携带大量蛋白质、核酸及脂质成分,整合来源细胞的有效刺激信息,有效实现信号的级联放大和远距离传输。Exosomes所携带、传递的信息成分多与其来源细胞/组织密切相关。糖尿病状态下,脂肪细胞来源外泌体（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）含有脂肪组织炎症及胰岛素抵抗的相关蛋白及核酸成分,能够通过作用于靶细胞诱发多种生物学功能,可能是链接胰岛素抵抗的脂肪组织与糖尿病动脉血管之间的重要桥梁,是整合机体多种刺激因素,诱发EndMT的关键载体。Sonic hedgehog（Shh）作为Hedgehog蛋白三种同源形式之一,表达最广泛,活性最高,是参与胚胎发育的关键蛋白。在肿瘤领域的研究发现,Shh具有激活Snail信号通路促进上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用,而EndMT是EMT的一种特殊类型。进一步研究证实,Snail信号通路亦是调节EndMT形成的关键信号通路。综上,我们提出研究假说:糖尿病状态下,携带Shh的AdExos增多,被内皮细胞摄取,AdExos通过其表面携带的Shh激活Snail依赖的EndMT过程,导致内皮细胞发生表型转换,逐渐向间质细胞转化,促进血管内膜增生,最终导致支架内再狭窄的发生。鉴于以上假说,我们将进行体内及体外实验,在整体和细胞水平研究脂肪细胞来源外泌体在血管再狭窄中的作用及具体机制。研究目的1.在整体动物水平证实AdExos通过其携带的Shh促进内皮间质转化,加剧血管内膜增生,进而影响糖尿病血管再狭窄的发生;2.从细胞水平探索AdExos促内皮间质转化的特性,验证AdExos通过其携带的Shh激活内皮细胞Snail信号通路并促进EndMT,为2型糖尿病PCI术后支架内再狭窄防治提供新的靶点。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型首先,我们通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基,黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,再通过高糖联合高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型,采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取及特征鉴定将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）;再采用透射电镜、动态光散射粒度仪、流式细胞仪及Western blot等方法进行AdExos的特征鉴定。4.2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型的构建4周龄的雄性ApoE-/-小鼠,适应性喂养1周后,禁食处理12～14小时,进行腹腔糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）后随机分为高脂饮食组和普通饮食组,高脂饮食组予以高脂饲料喂养,普通饮食组予以普通生长繁殖饲料喂养;6周后再次进行IPGTT试验,出现胰岛素抵抗的高脂饮食组小鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）（剂量标准为75mg/kg）,普通饮食组小鼠给予同等剂量的枸橼酸钠缓冲液进行腹腔注射;继续以原饲料喂养2周后,再次进行IPGTT试验和随机血糖检测,如果小鼠的随机血糖水平≥11.1mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象,则纳入2型糖尿病组。对2型糖尿病组小鼠和对照组小鼠通过植入股动脉袖套的方法构建血管再狭窄模型。分别给予生理盐水、IR-AdExos及IR-AdExosshh-经尾静脉注射,最后得到动物分组分别为普通饮食再狭窄组（Chow）、普通饮食+IR-AdExos再狭窄组（Chow+IR-AdExos）、普通饮食+IR-AdExosshh-再狭窄组（Chow+IR-AdExosshh）、糖尿病再狭窄组（DM）、糖尿病+IR-AdExos再狭窄组（DM+IR-AdExos）及糖尿病+IR-AdExosshh-再狭窄组（DM+IR-AdExosshh-）。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取为了验证小鼠血管能够摄取AdExos,我们采用PKH26染料标记AdExos,经尾静脉注射入再狭窄模型小鼠,制作血管标本切片,通过免疫荧光染色观察AdExos在体内的摄取情况。6.病理组织学染色观察血管再狭窄情况对股动脉再狭窄部位组织标本切片进行Hematoxylin-eosin staining（HE）染色、Verhoeffs Van Gieson弹性纤维染色及免疫组化染色,观察血管再狭窄情况。7.免疫荧光染色检测再狭窄部位EndMT发生情况通过进行 CD31 和 SM22α、CD31 和 Vimentin、Ve-Cadherin 和 SM22α、Ve-Cadherin和Vimentin免疫荧光共定位染色的方法检测血管再狭窄部位EndMT的发生情况。8.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞发生内皮间质转化的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,采用鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。9.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测细胞中EndMT发生情况再将所获取的Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过免疫荧光染色及Western blot的方法评价内皮标记物和间质标记物的表达变化及EndMT的发生情况。10.Western blot 检测分子机制方面,取AdExos及重组蛋白刺激孵育后的小鼠主动脉内皮细胞,提取蛋白质,采用Western blot方法检测Shh、内皮细胞及间质细胞标记物的表达及信号通路分子的表达情况。研究结果1.建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型3T3-L1前脂肪细胞诱导分化至成熟脂肪细胞后,细胞质内出现较多、较大的脂滴;高糖高胰岛素条件培养成熟脂肪细胞24h后,脂肪细胞总蛋白中总IRS1表达量显着减少,磷酸化Ser307位点的IRS1表达量显着增高,Akt的磷酸化水平降低;脂肪细胞细胞膜蛋白Glut4表达减少而细胞浆蛋白Glut4表达增加,提示胰岛素抵抗状态下Glut4细胞膜转位减少;胰岛素抵抗状态下,脂肪细胞脂质沉积增多。上述结果表明我们成功建立了 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。2.AdExos的分离提取及特征鉴定透射电镜观察下发现AdExos呈膜包被的囊泡状,直径在30～100nm范围内;动态光散射粒度仪结果表明AdExos直径范围分布于30～100nm;Western blot及流式细胞学结果表明AdExos阳性表达CD63、TSG101及CD81,而不表达GRP94和Calnexin。3.构建2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型ApoE-/-小鼠通过高脂饮食饲养联合链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）一次性注射的方法构建2型糖尿病模型,糖尿病小鼠随机血糖≥11.1 mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象。在此模型的基础上,通过股动脉袖套植入的方式构建再狭窄模型。4.糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子通过Western blot方法检测对照组和糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体蛋白中Shh分子的表达情况,结果表明糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体中Shh含量显着高于对照组,证明糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取在免疫荧光显微镜下进行观察,发现PKH26标记的AdExos呈红色荧光,分布于小鼠血管范围内,证明小鼠血管能够成功摄取AdExos。6.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进血管再狭窄高分辨率显微超声技术检测股动脉收缩期最大流速（Peak systolic velocity,PSV）,HE染色分析血管再狭窄,综合二者结果确定血管再狭窄情况。结果表明,糖尿病组小鼠股动脉再狭窄情况与普通饮食组相比明显加重;与普通饮食组或糖尿病组相比,普通饮食+IR-AdExos组或糖尿病+IR-AdExos组的再狭窄情况进一步加重;而Shh蛋白敲减后的IR-AdExos,其促血管再狭窄的能力有所下降,即普通饮食+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄较普通饮食+IR-AdExos组小鼠更轻,糖尿病+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄程度比糖尿病+IR-AdExos组小鼠更轻。7.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进股动脉再狭窄部位EndMT的发生通过免疫荧光共定位的方法检测血管再狭窄部位发生EndMT的情况,免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（SM22α、Vimentin）则记为发生内皮细间质转化的细胞。结果表明糖尿病状态下,内皮细胞标志物减少,间质细胞标志物增加,提示发生EndMT;尾静脉注射IR-AdExos能够进一步促进EndMT的发生,而敲减Shh的IR-AdExos其促EndMT作用减弱,证明IR-AdExos表面的Shh分子是IR-AdExos发挥促EndMT作用的主要分子靶点。8.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。9.AdExos促进内皮细胞发生EndMT将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞后,通过免疫荧光共定位的方法检测内皮细胞EndMT的发生。免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（α-SMA、FAP、FSP-1）则记为发生内皮细间质转化的细胞。与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞发生EndMT增多;与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组发生EndMT的内皮细胞数量并无显着增加,而IR-AdExosshh+组中发生EndMT的内皮细胞数量进一步增加;TGF-β作为阳性对照,在其刺激下,发生EndMT的内皮细胞数量显着增加;SHH重组蛋白刺激组中,发生EndMT的内皮细胞数量也有显着增加。上述结果表明,IR-AdExos能够促进内皮细胞发生EndMT,且该作用是经由其携带的Shh分子发挥的。另,TGF-β及SHH也具有促进内皮细胞发生EndMT的作用。10.IR-AdExos促进血管再狭窄EndMT的分子机制与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞中Snail和Slug表达显着升高。证明IR-AdExos的促EndMT作用是通过其表面的Shh作用于下游的Snail和Slug分子发挥作用。研究结论1.胰岛素抵抗条件下,脂肪细胞中脂质含量增多,脂肪细胞来源外泌体富集Shh分子;2.IR-AdExos能够通过携带的Shh分子,经由Shh/Snail/Slug信号通路促进小鼠主动脉内皮细胞发生EndMT;3.富集Shh的IR-AdExos能够明显促进血管内皮细胞发生间质转化,进而加剧糖尿病小鼠血管再狭窄的发生,可能是糖尿病脂肪组织促进血管再狭窄的重要机制之一,IR-AdExos有望成为进一步防治糖尿病ISR的新靶点。研究背景糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的重大慢性疾病之一。近年来,我国糖尿病患病率增长迅速,中国已成为全球糖尿病患者总数最多的国家。心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因。粥样斑块破裂导致的急性冠脉综合征是糖尿病患者心血管事件的主要原因。但是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的机制尚未完全阐明。循证医学证据表明,积极控制血糖可以降低糖尿病患者微血管病变的发生率,但强化降糖治疗能否降低2型糖尿病患者心血管事件的发生率尚未得到证实。这提示血糖和胰岛素水平仅能反映代谢水平,而不是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的根本原因。因此,亟需深入探讨糖尿病患者大血管并发症增加的深层次机制。既往研究发现动脉粥样硬化斑块内常出现病理性新生血管,且在易损斑块和斑块易损部位尤为明显,与斑块稳定性密切相关。病理性新生血管是动脉粥样硬化易损斑块形成的关键环节。越来越多的证据表明,动脉损伤部位病理性新生血管形成与粥样硬化斑块引起的急性冠脉综合症有关,这些斑块脆性较大且易发生破裂,进而导致血管阻塞。除了斑块内出血机制以外,病理性新生血管还通过白细胞征募来促进动脉粥样硬化斑块的不稳定性。2型糖尿病和动脉粥样硬化同属慢性炎症性疾病,在2型糖尿病状态下,脂质在脂肪细胞中不断存储,随着脂肪细胞逐渐增大,导致脂肪细胞功能失调,脂肪因子分泌紊乱,大量促炎因子合成释放,引发全身代谢性炎症反应、胰岛素抵抗,从而加速斑块进展,促进易损斑块的形成。此外,有研究发现,脂肪细胞能够分泌内皮特异性丝裂原和促血管生长因子,参与新生血管的形成。但功能失调的脂肪组织如何促进斑块内新生血管的形成,从而促进斑块发生发展的确切机制至今尚未见报道。近期,有学者认为外泌体（Exosomes）是脂肪组织与血管间信息传递的重要载体。Exosomes是由多种细胞（如血小板、内皮细胞、单核细胞等）产生的,携带大量与其细胞/组织来源和功能密切相关的蛋白质、核酸和脂质成分。可实现信号的级联放大和远距离传输。在人体内所有exosomes中,脂肪细胞来源的exosomes（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）与糖尿病动脉粥样硬化的发生发展及新生血管形成的关系日益引起人们的关注。Hulsmans等认为,AdExos是将脂肪组织产生的炎症及氧化应激信息传递到血管的重要使者,从而引起内皮损伤、诱发动脉粥样硬化。但是,AdExos对于斑块稳定性变化及斑块内病理性新生血管的形成有无影响尚未见报道。研究发现AdExos富含纤粘连蛋白、层粘连蛋白,有利于循环中的AdExos粘附、迁移、浸润于内皮细胞。糖尿病慢性低度炎症状态下,受损的内皮细胞通透性增加且炎症因子（IL-6、IL-8）、趋化因子（MCP-1）、粘附因子（VCAM-1、E-selectin）表达上调,为循环中的AdExos粘附、浸润创造了良好的条件。此外,AdExos携带丰富的促血管生成miRNA,如miR221、miR27b、miR21、miR17～92等。脂肪组织作为内分泌器官,是多器官间相互联系的纽带。Hedgehog 蛋白在哺乳动物中有 Sonichedgehog（Shh）、Indianhedgehog（Ihh）及Desert hedgehog（Dhh）三种同源形式,其中Shh表达最广泛,活性最高。Hedgehog在斑马鱼胚胎发育中通过VEGF促进主动脉生成。Shh缺失的小鼠发育中的肺缺乏正常血管化的能力。Hedgehog信号可通过控制众多促血管生成因子包括VEGF-a,VEGF-b,VEGF-c及AngII的表达而调控新生血管的生成。Hedgehog蛋白促血管生成功能的发挥是通过连接到一种12次跨膜受体蛋白--Patched实现的。在正常情况下,Patched受体与另一种7次跨膜受体蛋白——Smoothened（Smo）相结合且抑制Smo的作用。当Hedgehog蛋白与Patched受体结合后,解除了对Smo的抑制作用,进而启动信号转导。Smo是Hedgehog信号通路的信息转换器,把细胞外的Hedgehog蛋白信号向细胞内传递,激活胶质瘤相关原癌基因（Glioma-associated oncogene homolog,Gli）转录因子。综上所述,我们提出了如下假说:糖尿病状态下,功能失调的脂肪组织释放入循环血液中的AdExos数量增多,其通过其表面的Hedgehog蛋白与内皮细胞上的Patched受体结合,促进病理性新生血管的形成,加速斑块进展及易损斑块的形成。研究目的1.从细胞水平分析AdExos促血管生成的特性;2.体外验证AdExos是否通过启动Hedgehog信号通路,促进新生血管的形成。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-LI前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。再通过高糖+高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）。4.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞血管新生能力的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。5.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测内皮细胞功能的改变将所获取的 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过PCNA/KI67免疫荧光染色检测内皮细胞增殖功能,通过细胞划痕实验检测迁移功能。6.小管形成实验检测AdExos促血管新生的特性将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,评价AdExos的促血管新生的能力。7.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用分子机制方面,给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺阻断Hedgehog信号通路,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,检测内皮细胞的小管形成功能。给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺和Gli抑制剂——Gant61刺激孵育,提取小鼠主动脉内皮细胞的蛋白质,通过Western blot方法检测信号通路分子的表达情况。研究结果1.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。2.IR-AdExos改变小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。首先进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量有所增加,IR-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量显着增加,以VEGF作为促血管新生的阳性对照用以刺激内皮细胞,结果发现,与对照组相比,VEGF刺激组中内皮细胞的PCNA及KI67表达量均显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的增殖功能。细胞划痕实验结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的细胞迁移率有增加,IR-AdExos细胞迁移率显着增加,VEGF刺激组细胞迁移率明显增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的迁移功能。3.AdExos促进小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果发现:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度增加,IR-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度显着增加,VEGF阳性对照组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够明显增强内皮细胞的小管形成功能。4.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞PCNA、KI67的表达量有所降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞中PCNA、KI67的表达量显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞增殖功能的重要分子。细胞划痕实验结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中细胞迁移率降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞细胞迁移率显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞迁移功能的重要分子。5.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞小管形成数量、分支长度降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞血管新生的重要分子。6.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用给予 Hedgehog 抑制剂环巴胺和 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos以及VEGF重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞,检测内皮细胞小管形成功能,结果表明IR-AdExos+环巴胺组的小管形成数量、分支长度显着降低,证明Hedgehog是AdExos促血管新生的关键分子。7.AdExos促血管新生信号通路分子的表达情况给予Hedgehog抑制剂环巴胺、Gli抑制剂Gant61及IR-AdExosshh+刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞。Western blot结果显示:IR-AdExosshh+刺激条件下,小鼠主动脉内皮细胞中Gli表达量显着升高;给予环巴胺和Gant61（Gli抑制剂）后,Gli表达量显着降低,证明AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。研究结论1.IR-AdExos能够增强小鼠主动脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能,促进血管新生;2.Shh是IR-AdExos促进内皮细胞功能改变的关键分子;3.IR-AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。
孙烁[8]（2021）在《多孔聚醚醚酮微球的制备、表面改性及在骨修复中的应用》文中指出研究目的:制备基于聚醚醚酮材料的多孔微球并进行表面改性处理,探究其在骨修复中的应用。材料与方法:1、前期工作中,利用液-液相置换法已制备出表面光滑的PEEK微球。本研究对光滑PEEK微球进行羟化处理,制备出多孔PEEK微球,对其进行电镜观察、傅里叶红外分析、压汞仪、水接触角、蛋白吸附能力和浸提液细胞毒性测试。进一步利用矿化培养和反复脱细胞技术,将矿化细胞外基质包被于多孔PEEK微球表面。使用电镜对矿化细胞外基质进行形貌观察,利用能量散射X线光谱仪和热重分析仪分别对其进行定性和定量检测。2、对多孔PEEK微球和表面包被矿化细胞外基质的多孔PEEK微球进行体外生物形容性和体内成骨性能瓶评估。通过钙黄绿素染色和电镜观察不同微球表面MC3T3-E1细胞黏附和细胞外基质分泌情况,DAPI染色和CCK法评估微球对于细胞增殖的影响。利用碱性磷酸酶染色和活性检测、茜素红染色和钙定量检测、Runx2和Col-1两种成骨相关基因表达情况评估微球体外成骨活性。构建大鼠颅骨缺损模型,通过Mirco-CT重建分析和组织切片苏木精-伊红和马松染色进一步评估微球的体内成骨效果。3、利用多巴胺（dopamine,DA）涂层的黏附特性,将胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）和骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）同时固定于多孔PEEK微球。对于黏附DA涂层后的微球进行颜色和表面形貌观察,利用X线光电子能谱分析表面元素组成和比例,接触角评估亲水性。酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）对微球表面黏附的生长因子量和14天内的释放行为进行分析。利用碱性磷酸酶染色和活性检测、茜素红染色和钙定量检测、Runx2、OPN和OCN三种成骨相关基因表达情况评估微球体外成骨活性。构建大鼠颅骨缺损模型,通过Mirco-CT重建分析和组织切片苏木精-伊红和马松染色进一步评估微球的体内成骨效果。结果:1、电镜观察表明,经过羟化处理后,多孔PEEK微球球形度保持良好,表面孔隙结构分布均匀。傅里叶红外分析显示,多孔微球表面羰基峰强度降低且出现新的羟基峰。压汞仪检测显示,多孔微球的孔隙率大于90%,平均孔径为569.72nm。同光滑微球相比,多孔微球的水接触角显着降低,蛋白吸附能力有所提升。经矿化培养和反复脱细胞处理后,微球表面经元素分析发现有氮、钙和磷元素的出现。通过电镜观察发现,随着脱细胞次数的增加,多孔微球表面包被的矿化细胞外基质更致密且分布更加均匀。热重分析仪的结果显示,随着脱细胞次数的增加,微球在400℃下的质量损失可从6.41%升至12.38%。多孔PEEK微球的浸提原液和稀释一倍后,其细胞存活率分别大于85%和95%。2、微球与MC3T3-E1细胞共培养后,在各观察时间点,钙黄绿素、DAPI染色、CCK检测和电镜观察显示,同光滑微球相比,多孔微球表面的细胞数目更多,细胞多呈扁平球状且伪足更多,细胞黏附状态更佳且细胞外基质的分泌更旺盛。随着脱细胞次数的增加,微球表面黏附的细胞量和CCK法检测细胞增殖的吸光度值不断提高。经碱性磷酸酶染色和茜素红染色,多孔微球表面的着色较光滑微球明显加深,碱性磷酸酶的活性、钙定量分析、Runx2和Col-1的表达水平也显着提高。多孔微球表面在包被矿化细胞外基质后,其上述体外成骨能力检测指标均进有明显提升。Micro-CT重建显示,包被矿化细胞外基质的微球组,4周时颅骨缺损区域已基本被覆盖,8周时其骨密度明显高于其它两组,骨组织分数分别为42.19±2.80%和65.19±1.63%,同样显着高于其它两组。组织切片染色发现,光滑微球周围以纤维组织包裹为主,且不能与周围新生组织形成强有力的键合,导致切片中出现较多的微球缺失。多孔微球周围则以新生骨组织为主,与周围新生组织键合紧密,没有出现微球缺失的情况。表面包被矿化细胞外基质的微球周围以成熟骨组织为主,结构致密且周围有较多新生血管。3、多孔微球表面黏附DA涂层后,颜色由之前的白色变为均一的灰黑色,电镜观察则无明显变化。元素分析表明黏附DA涂层后,微球表面出现氮元素,定量分析表明,DA涂层黏附IGF-1后,氮元素占比由1.58%升至1.71%。DA涂层可以将多孔微球的水接触角由65.88±4.55°降至51.08±3.7°。ELISA检测证实,DA涂层可将生长因子固定于多孔PEEK微球且在14天内具有较为缓慢的释放曲线。微球与MC3T3-E1细胞共培养后,在各观察时间点,钙黄绿素、DAPI染色、CCK检测显示,含有IGF-1的微球组细胞黏附状态更佳且细胞数目更多,CCK检测表明,双生长因子组的增值率略低于IGF-1组,差异无显着性,但显着高于其它各组。经碱性磷酸酶染色和茜素红染色,含BMP-2的微球组着色明显加深,但单一BMP-2组与双生长因子差异不明显。含有双生长因子微球的碱性磷酸酶活性、钙定量分析、14天时Runx2、OPN和OCN的表达水平也显着高于其它各组。MicroCT重建显示,双生长因子组在8周时不仅能将缺损区域完全覆盖,且其骨密度较高,骨缺损区域的中央几乎与缺损边缘等高。冠状位CT影像上可观察到在可透射线PEEK微球的上方有骨性连接,形成“骨桥”结构,将骨缺损边缘和中央区的新生骨进行连接。双生长因子组在8周时的骨组织分数为85.79±6.20%,显着高于其它各组。组织切片染色观察可见,双生长因子组骨组织结构致密且以成熟骨组织为主,血管更为密集。结论:1、光滑PEEK微球经过羟化处理后可制备出表面孔隙结构均一的多孔PEEK微球。2、通过改变接收液的温度和成分比例可以调控微球表面的孔径大小。3、利用矿化培养和脱细胞技术,可以在多孔PEEK微球表面成功包被矿化细胞外基质,且随着脱细胞次数的增加其质量分数更高、分布更均匀。4、多孔微球同光滑微球比更有利于细胞的黏附、增殖,促进了细胞外基质的分泌。5、多孔PEEK微球在表面包被矿化细胞外基质后,进一步促进了细胞的黏附和增殖,提高了碱性磷酸酶的活性、钙质沉积能力和成骨相关基因表达水平,大鼠颅骨缺损的修复效果更优异。6、DA涂层可将IGF-1和BMP-2两种生长因子固定于多孔PEEK微球,在14天内均有较为缓慢的释放行为。7、负载双生长因子的微球同单一种类生长因子相比,其体外成骨诱导能力和大鼠颅骨缺损修复效果均有所提高。本研究的创新之处:1、通过羟化处理,一步法实现微球表面化学和物理双改性。2、利用矿化培养和反复脱细胞技术在微球表面成功包被矿化细胞外基质。3、IGF-1和BMP-2联用促进骨修复效果,可降低单一生长因子使用剂量。
查小英[9]（2021）在《松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料的制备及应用研究》文中指出作为人体最大的器官,皮肤对维持人体内环境稳定和身体的正常生理功能有着重要作用。然而,慢性皮肤病伤口经常破坏皮肤的完整性,可能通过诸如细菌感染,炎症,组织坏死等对人体造成严重的创伤。为了有效地治疗伤口,伤口敷料经常用于恢复皮肤的正常功能和促进伤口愈合。丝素蛋白（Silk Fibroin,SF）因其可降解、生物相容性良好和机械强度可调等优点,已成为制备理想伤口敷料的首选天然高分子材料之一。本文选用SF作为基底材料,天然药物松萝酸（Usnic Acid,UA）作为抗菌剂,通过静电纺丝法制备了松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料（Usnic Acid-Silk Fibroin Composite Wound Dressing,USCWD）,并对其各项性能及应用价值进行检测和研究。具体研究内容及结果如下:（1）USCWD的制备及性能检测。利用天然蚕茧提取SF水溶液,浓缩后的SF溶液与UA混合,通过静电纺丝法制备USCWD。对USCWD表面微观形貌、化学结构、机械性能、降解特性、透气性（Water Vapor Transmission Rate,WVTR）、药物释放行为进行表征与测试。扫描式电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）结果显示:USCWD由平均直径为360±10 nm的纤维交叉缠绕成纳米纤维支架,该特殊结构赋予了USCWD高于商用敷料Tegaderm Hydrocolloid 3M近乎2倍的WVTR。甲醇短时间浸泡,可将USCWD内部的β-sheet含量从15.45%（处理前）增加至50.27%（处理后）;且在SF浓度一定时（20 wt%）,将USCWD的最终张力强度（Ultimate Tensile Strength,UTS）从1.68±0.41 MPa（处理前）提高至2.61±0.61MPa（处理后）;同时在很大程度上降低了USCWD体外降解的速率;并将药物释放时间延长至8天,克服了传统敷料可能出现的爆发式药物释放。（2）对USCWD的生物性能研究。本研究首先选择革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）、化脓性链球菌（Streptococci pyogenes,S.pyogenes）和革兰氏阴性菌:大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa）对USCWD的抗菌性能进行验证;其次通过NIH3T3成纤维细胞检验USCWD的生物相容性;最后通过小鼠背部全层皮肤厚度伤口模型检测其促伤口愈合的能力及可能的机制。研究结果表明,在固态平板抗菌与细菌悬液抗菌两种抗菌方式下,USCWD对革兰氏阳性菌表现出超高的敏感性:抑菌指数分别高达2.02±0.09和12.01±0.25,同时能有效抑制革兰氏阴性菌的生长:抑菌指数分别为1.65±0.08和1.19±0.01。NIH3T3成纤维细胞培养在USCWD的浸泡液中,存活率高达99%,且细胞形态正常;细胞能够在USCWD上进行正常的生理活动。USCWD与Tegaderm Hydrocolloid 3M相比较,用USCWD处理的小鼠背部伤口在第3天表现出明显的收缩,病理切片的染色结果也验证了USCWD比Tegaderm Hydrocolloid 3M具有更快的细胞角蛋白-10（Cytokeratin-10,CK10）和血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）形成,缩短了伤口愈合的时间。综上所述,本研究利用SF和UA通过静电纺丝法制备出的USCWD具有可调的机械性、良好的降解性、透气性、抗菌性、生物相容性等多重优点,并能有效促进伤口愈合,为改善慢性伤口修复提供了潜在应用。
姚之肖[10]（2020）在《人脐带间充质干细胞外泌体对肌腱修复的作用及相关机制研究》文中指出目的肌腱损伤愈合是手外科亟待解决的难题之一。肌腱损伤后自然愈合缓慢且肌腱愈合过程中粘连似乎难以避免。探索促进肌腱愈合及预防愈合过程的肌腱粘连的治疗策略迫切需要创新性理论指导和技术支持。近年来,外泌体做为新一代无细胞治疗剂在组织修复领域颇具潜力,HUMSC凭借独特优势成为最具吸引力的外泌体供体之一。本课题拟通过体内体外实验,探索HUMSC-Exos是否能促进肌腱愈合及预防肌腱粘连,并探索潜在作用机制,为肌腱损伤愈合提供新的治疗策略。方法第一部分,体内构建大鼠跟腱缺损愈合模型,通过局部应用HUMSC-Exos,评估肌腱愈合情况。体外采用TDSC作为细胞模型,评估HUMSC-Exos对细胞增殖和基因表达的作用。Mi RNA测序及q-PCR分析确认差异miRNA。特异性miRNA激动剂（agomir-29a-3p）改造HUMSC-Exos,获得修饰外泌体,验证其功效及相关作用机制。第二部分,体内构建大鼠跟腱损伤粘连模型,通过局部注射HUMSC-Exos,评估肌腱粘连情况。体外用TGF-β1和/或HUMSC-Exos处理大鼠成纤维细胞系,观察细胞增殖、凋亡及基因表达情况。Mi RNA测序及q-PCR分析确认差异miRNA。特异性miRNA拮抗剂（antagomir-21a-5p）改造HUMSC-Exos,获得修饰后外泌体,验证其功效及相关作用机制。第三部分,体内构建大鼠跟腱损伤粘连模型,通过局部应用抗肿瘤药物HCPT评估肌腱粘连情况。体外用TGF-β1和/或HCPT处理细胞后,检测大鼠成纤维细胞的增殖、凋亡及基因表达情况。Salubrinal和si RNA/sh RNA验证HCPT的作用是否依赖于ERS信号通路。第四部分,HCPT预处理HUMSC获得修饰HUMSC-Exos（HCPT-Exos）。在体外分别评估HCPT-Exos和HUMSC-Exos对大鼠成纤维细胞增殖、凋亡及基因表达的作用。用salubrinal验证HCPT-Exos的优势作用是否依赖ERS信号通路。结果HUMSC-Exos局部应用促进大鼠跟腱愈合,并促进TDSC细胞增殖及肌腱标志物表达。Mi RNA测序表明,miR-29a-3p在HUMSC-Exos中富集。特异性miR-29a-3p激动剂改造HUMSC,以获得高表达miR-29a-3p的HUMSC-Exos,进一步的体内和体外实验证实其增强的促肌腱愈合作用,且与激活TGF-β1/Smad3/m TOR信号级联有关。其次,局部注射HUMSC-Exos后大鼠跟腱粘连缓解。在体外HUMSC-Exos抑制了TGF-β1诱导的大鼠成纤维细胞增殖以及COL3A1和α-SMA的表达。Mi RNA测序和q-PCR证实了miR-21a-5p在HUMSC-Exos中低表达。特异性miR-29a-3p拮抗剂改造HUMSC,以获得低表达miR-21a-5p的HUMSC-Exos,随后的体外实验证实其增强的抗肌腱粘连/纤维化作用,可能与调控p65活性有关。然后,我们观察到局部应用HCPT后能抑制大鼠跟腱粘连。在体外HCPT诱导大鼠成纤维细胞凋亡且抑制TGF-β1诱导的细胞增殖以及COL3A1和α-SMA的表达。成纤维细胞经ERS抑制剂salubrinal以及ERS信号通路（PERK、IRE-1和ATF-6）RNA干扰预处理后,HCPT的抗纤维化作用被抑制,表明其抗纤维化作用依赖于ER相关的细胞凋亡。最后,HCPT预处理HUMSC,收获修饰HCPT-Exos,其抑制细胞增殖促进凋亡及抑制纤维化基因表达方面均优于HUMSC-Exos。Salubrinal预处理部分消除了HCPT-Exos的优势,表明HCPT-Exos优势抗纤维化作用可能依赖ERS信号通路。结论HUMSC-Exos促进肌腱愈合并预防肌腱粘连,且与外泌体中差异表达的miRNA密切相关。工程化修饰或药物修饰外泌体可进一步增强其作用,这为肌腱损伤修复提供了理论基础和新的治疗策略,为临床级肌腱损伤治疗提供有力支撑。
二、新一代ECM公司:New Interwoven（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新一代ECM公司:New Interwoven（论文提纲范文）
（1）基于微服务架构和国密算法的高速公路收费认证平台设计（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景和意义 |
| 1.2 研究现状 |
| 1.2.1 高速公路联网收费研究现状 |
| 1.2.2 微服务框架研究现状 |
| 1.2.3 高速公路收费系统国密算法研究现状 |
| 1.3 主要研究内容 |
| 1.4 论文的组织结构 |
| 第二章 高速公路联网收费认证平台需求分析 |
| 2.1 功能性需求分析 |
| 2.2 非功性能需求 |
| 2.3 接口需求分析 |
| 2.3.1 平台内部接口 |
| 2.3.2 平台对外接口 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 高速公路联网收费认证平台设计 |
| 3.1 微服务架构设计 |
| 3.2 管理和认证处理逻辑设计 |
| 3.2.1 国密算法兼容 |
| 3.2.2 密钥管理 |
| 3.2.3 证书管理 |
| 3.2.4 发行认证 |
| 3.2.5 充值认证 |
| 3.2.6 交易认证 |
| 3.3 关键算法设计 |
| 3.3.1 申请和下载证书算法 |
| 3.3.2 身份认证算法 |
| 3.3.3 设备激活算法 |
| 3.3.4 交易认证算法 |
| 3.4 数据库表结构设计 |
| 3.4.1 密钥管理数据表 |
| 3.4.2 证书管理数据表 |
| 3.4.3 发行认证数据表 |
| 3.4.4 充值认证数据表 |
| 3.4.5 交易认证数据表 |
| 3.5 关键模块设计 |
| 3.5.1 密钥管理子系统 |
| 3.5.2 证书管理子系统 |
| 3.5.3 发行认证子系统 |
| 3.5.4 充值认证子系统 |
| 3.5.5 交易认证子系统 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 高速公路联网收费认证平台实现测试 |
| 4.1 平台开发环境 |
| 4.2 平台关键模块实现 |
| 4.3 平台运行和测试结果 |
| 4.3.1 平台运行和测试 |
| 4.3.2 测试记录和分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结 |
| 5.1 主要工作贡献与创新 |
| 5.2 下一步工作 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文情况 |
（2）基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 黄韧带肥厚的机制及动物模型建立的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 TGF-β1/Smads信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本收集 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 影像学测量 |
| 1.4 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.5 手术方式 |
| 1.6 标本的取材、运输等标准操作规程 |
| 1.7 HE染色与组织形态学观察 |
| 1.8 Masson染色与纤维化观察 |
| 1.9 免疫组化法检测两组黄初带IL-lp、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1和Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.10 实时焚光聚合酶链式反应（Real-Time PCR)检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3&mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 HE染色结果 |
| 2.3 Masson染色结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 Real-Time PCR结果 |
| 2.6 DLSS组内黄韧带厚度和各层纤维化分级的相关性分析 |
| 2.7 DLSS组内黄韧带厚度和各层弹性-胶原纤维比的相关性分析 |
| 2.8 DLSS组内黄韧带厚度和各层mRNA表达的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 炎症与纤维化是黄韧带肥厚的主要病理机制 |
| 3.2 黄韧带背侧层是退变的起点 |
| 3.3 基于“阳化气,阴成形”理论探讨黄韧带“炎症-纤维化”病理过程 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨DLSS的中医药治疗 |
| 3.5 其他 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.3 实验动物的分组与取材 |
| 1.4 实验动物的造模 |
| 1.5 影像学测量 |
| 1.6 HE染色与大鼠黄韧带厚度的测量 |
| 1.7 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化观察 |
| 1.8 免疫组化法检测各组黄初带IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1、Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.9 免疫印迹法定性、半定量分析IL-1β、TNF-α、TGF-β1和Coll蛋白在各组黄韧带内表达 |
| 1.10 Real-Time PCR检测 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3的mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HE染色与大鼠黄韧带厚度的结果 |
| 2.2 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化的结果 |
| 2.3 影像学测量结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 免疫印迹结果 |
| 2.6 Real-Time PCR结果 |
| 2.7 大鼠黄韧带与人增厚黄韧带的比较 |
| 2.8 模型成功率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大鼠黄韧带肥厚模型的建立方法 |
| 3.2 大鼠黄韧带肥厚的病理表现 |
| 3.3 机械应力是诱发或加速黄韧带肥厚的重要因素 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨大鼠黄韧带增厚模型的建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）CGF对共培养人骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞促成骨成血管作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 三种富血小板衍生物的制备及主要生长因子分析 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 不同浓度CGF对共培养h BMSC及 HUVEC增殖作用的研究 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 不同浓度CGF对直接共培养h BMSC和 HUVEC成骨成血管分化的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四部分 10%CGF促直接共培养hBMSC成骨作用机制的初步研究 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 富血小板衍生物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）野百合碱与缺氧诱导的肺动脉高压蛋白质组学分析（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试剂配置 |
| 1.4.1 大鼠建模试剂的配制 |
| 1.4.2 蛋白印迹试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 肺动脉高压大鼠模型的建立 |
| 2.2 肺动脉高压大鼠模型的鉴定 |
| 2.2.1 大鼠右心室收缩压和右心室重量指数的测定 |
| 2.2.2 肺动脉血管的HE染色 |
| 2.3 蛋白提取与酶解 |
| 2.4 液相色谱-质谱联用分析 |
| 2.5 数据库搜索 |
| 2.6 蛋白注释与功能富集 |
| 2.7 基于蛋白功能富集的聚类分析 |
| 2.8 实时荧光定量PCR验证信号通路中相关基因表达 |
| 2.8.1 RNA的提取 |
| 2.8.2 cDNA的合成 |
| 2.8.3 RT-qPCR分析 |
| 2.9 蛋白印迹验证信号通路中相关基因表达 |
| 2.9.1 MCT组和NOR组肺动脉组织蛋白的提取 |
| 2.9.2 蛋白浓度的测定 |
| 2.9.3 蛋白印迹分析 |
| 2.10 蛋白质组数据的进一步分析 |
| 2.11 统计分析 |
| 结果 |
| 1 大鼠肺动脉高压模型的验证 |
| 1.1 MCT和OD诱导的大鼠右心室收缩压的测定 |
| 1.2 MCT和OD诱导的大鼠右心室重量指数的测定 |
| 1.3 MCT和OD诱导的大鼠的肺动脉血管形态变化 |
| 2 蛋白质组学分析 |
| 2.1 蛋白质组学结果综述 |
| 2.2 样品重复性检验 |
| 2.3 蛋白注释以及差异表达蛋白的功能分类 |
| 2.4 差异表达蛋白的功能富集分析与聚类分析 |
| 3 信号通路中相关蛋白的验证 |
| 3.1 RT-qPCR验证信号通路中相关基因 |
| 3.2 蛋白印迹分析验证信号通路中相关蛋白 |
| 4 蛋白质组学数据的进一步分析 |
| 4.1 蛋白质组数据的基因集富集分析 |
| 4.2 蛋白互作网络绘制和中心节点蛋白质筛选 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肺动脉高压相关的蛋白质组学研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）青少年开角型青光眼的全外显子测序分析研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 青光眼的定义及分类 |
| 1.2 JOAG概述 |
| 1.3 JOAG的基因学研究背景 |
| 1.3.1 JOAG的基因学研究意义 |
| 1.3.2 POAG的基因学研究现状 |
| 1.3.3 POAG的全基因组关联分析研究 |
| 1.3.3.1 POAG相关GWAS变异基因位点 |
| 1.3.3.2 眼内压(IOP)相关GWAS变异基因位点 |
| 1.3.3.3 视杯(Optical cup)相关GWAS变异基因位点 |
| 1.3.3.4 视盘(Optical disk)相关GWAS变异基因位点 |
| 1.3.3.5 杯盘比(VCDR)相关GWAS变异基因位点 |
| 1.3.3.6 中央角膜厚度(CCT)相关GWAS变异基因位点 |
| 1.4 本课题的研究内容 |
| 1.5 本课题的来源 |
| 第二章 方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 眼科临床检查方法 |
| 2.3 病例组及对照组完成全基因组外显子测序技术基因测序 |
| 2.4 文献检索POAG的GWAS关联基因 |
| 2.5 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 POAG GWAS发现的变异基因位点分析 |
| 3.1.1 POAG GWAS关联变异基因位点 |
| 3.1.2 POAG GWAS关联变异基因位点的基因功能集群分析 |
| 3.1.3 POAG GWAS关联变异基因位点的基因功能和细胞信号通路分析 |
| 3.2 POAG GWAS关联变异基因位点在实验组中的筛查结果与分析 |
| 3.2.1 筛查结果中罕见编码变异位点的统计分析 |
| 3.2.2 筛查结果中5个病人存在同源染色体基因的罕见编码变异 |
| 3.2.3 筛查结果中罕见编码变异位点的基因功能集群分析 |
| 3.2.4 筛查结果中罕见编码变异位点的基因功能及细胞信号通路分析 |
| 3.2.5 筛查结果中15个高频变异位点的眼部组织差异化表达相关度分析 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 符号缩略表 |
| 综述 原发性开角型青光眼全基因组关联分析的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）Cinaciguat通过上调PKG2改善2型糖尿病大鼠种植体骨结合的作用效果及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 2型糖尿病对大鼠种植体骨结合、成骨细胞生物学功能及PKG2表达水平的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 过表达PKG2对体外高糖高脂环境诱导的成骨细胞功能损伤的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 应用Cinaciguat对2型糖尿病所致的成骨细胞功能障碍及种植体骨结合不良的改善作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 Cinaciguat逆转2型糖尿病环境对成骨细胞损害作用的蛋白组学分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第五部分 Cinaciguat通过PKG2改善2型糖尿病所致成骨细胞功能障碍的具体机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 附录 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 脂肪细胞来源外泌体介导的内皮间质转化在糖尿病血管再狭窄中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 脂肪细胞来源外泌体在血管新生中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
| SCI论文Ⅲ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）多孔聚醚醚酮微球的制备、表面改性及在骨修复中的应用（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 骨再生的策略 |
| 1.2.1 骨结构的生物学原理 |
| 1.2.2 骨再生的机制 |
| 1.2.3 骨植入材料的设计 |
| 1.3 骨植入物的分类 |
| 1.3.1 自体移植物 |
| 1.3.2 同种异体移植物 |
| 1.3.3 异种骨移植 |
| 1.3.4 已塑形骨组织工程材料 |
| 1.3.5 可注射骨植入材料 |
| 1.4 多孔微球在骨修复中的应用 |
| 1.4.1 多孔微球的特征 |
| 1.4.2 制备多孔微球的材料与方法 |
| 1.4.3 多孔微球的应用 |
| 1.5 本论文的研究目标、内容及创新 |
| 1.5.1 研究目标 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 研究创新点 |
| 第2章 表面包被矿化细胞外基质的多孔PEEK微球的制备与表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 液-液相分离的原理 |
| 2.3.2 表面光滑PEEK微球的制备 |
| 2.3.3 表面多孔PEEK微球的制备 |
| 2.3.4 表面光滑与多孔PEEK微球的表征 |
| 2.3.5 PEEK微球蛋白吸附能力测试 |
| 2.3.6 PEEK微球的亲水性能表征 |
| 2.3.7 表面包被矿化细胞外基质的多孔PEEK微球的制备与表征 |
| 2.3.8 浸提液细胞毒性检测 |
| 2.3.9 统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 光滑PEEK微球的表面与剖面微结构 |
| 2.4.2 多孔PEEK微球的表面与剖面微结构 |
| 2.4.3 多孔PEEK微球的FTIR表征 |
| 2.4.4 PEEK微球的亲水性表征 |
| 2.4.5 多孔PEEK微球的蛋白吸附能力分析 |
| 2.4.6 矿化细胞外基质的形貌观察和元素分析 |
| 2.4.7 表面包被矿化细胞外基质PEEK微球的热失重分析 |
| 2.4.8 浸提液细胞毒性 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 表面包被矿化细胞外基质的多孔PEEK微球的体外生物相容性评估和体内成骨性能评估 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验仪器和材料 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞黏附形态荧光染色观察 |
| 3.3.2 细胞增殖检测 |
| 3.3.3 电镜下观察细胞形态和细胞外基质 |
| 3.3.4 脱细胞-再种植后的黏附荧光染色与增殖检测 |
| 3.3.5 碱性磷酸酶染色及活性检测 |
| 3.3.6 茜素红染色及钙定量检测 |
| 3.3.7 Runx2和Col-I实时荧光定量PCR检测 |
| 3.3.8 大鼠颅骨缺损模型的构建 |
| 3.3.9 Micro-CT数据重建及分析 |
| 3.3.10 组织切片染色观察 |
| 3.3.11 统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 细胞黏附形态和细胞外基质的分泌 |
| 3.4.2 细胞增殖 |
| 3.4.3 脱细胞-再种植后的黏附与增殖分析 |
| 3.4.4 碱性磷酸酶染色及活性分析 |
| 3.4.5 茜素红染色及定量分析 |
| 3.4.6 成骨相关基因分析 |
| 3.4.7 Micro-CT重建及分析评价 |
| 3.4.8 组织切片H&E及Masson染色分析 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 多孔PEEK微球表面聚多巴胺涂层黏附IGF-1 和BMP-2 双生长因子的骨修复研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 DA涂层及负载双生长因子的多孔PEEK微球的制备 |
| 4.3.2 DA涂层多孔PEEK微球的表征 |
| 4.3.3 ELISA法检测微球生长因子负载量及缓释行为 |
| 4.3.4 负载双生长因子多孔PEEK微球的体外生物相容性研究 |
| 4.3.5 负载双生长因子多孔PEEK微球的体内骨修复研究 |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 DA涂层多孔PEEK微球的表征 |
| 4.4.2 ELISA法检测微球生长因子负载量并评估缓释行为 |
| 4.4.3 体外成骨性能评估 |
| 4.4.4 负载双生长因子多孔PEEK微球的大鼠颅骨缺损修复 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 结论 |
| 本研究的特色与创新之处 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料的制备及应用研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 引言 |
| 2 人体皮肤的结构及功能 |
| 3 皮肤伤口的愈合过程及愈合机理 |
| 4 常见的伤口敷料的特点 |
| 4.1 传统的伤口敷料 |
| 4.2 现有的伤口敷料 |
| 4.3 理想的伤口敷料 |
| 5 丝素蛋白基伤口敷料概述 |
| 5.1 丝素蛋白的应用 |
| 5.1.1 丝素蛋白的结构与性能 |
| 5.1.2 丝素蛋白的应用概述 |
| 5.2 丝素蛋白基伤口敷料的研究现状 |
| 6 松萝酸的应用概述 |
| 6.1 松萝酸的结构与活性机理 |
| 6.2 松萝酸的应用简介 |
| 7 本章小结 |
| 8 论文结构 |
| 第二章 松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料的制备及性能检测 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂和仪器 |
| 2.2 丝素蛋白的提取 |
| 2.3 松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料的制备 |
| 3 松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料的结构表征 |
| 3.1 表面微观形貌表征 |
| 3.2 化学结构表征 |
| 4 松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料的性能检测 |
| 4.1 机械性能测试 |
| 4.2 体外降解性能测试 |
| 4.3 透气性能测试 |
| 4.4 药物缓释测试 |
| 5 松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料的生物活性研究 |
| 5.1 抗菌性能检测 |
| 5.2 生物相容性检测 |
| 5.3 小鼠背部全层皮肤厚度伤口愈合性能检测 |
| 6 本章小结 |
| 第三章 松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料的性能检测结果与讨论 |
| 1 松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料的结构及性能 |
| 1.1 表面微观形貌观察结果 |
| 1.2 化学结构分析 |
| 1.3 机械性能测试结果 |
| 1.4 体外降解特性测试结果 |
| 1.5 透气性能测试结果 |
| 1.6 药物缓释结果分析 |
| 2 松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料的生物活性研究结果 |
| 2.1 抗菌效果展示 |
| 2.2 生物相容性分析 |
| 2.3 小鼠背部全层皮肤厚度伤口愈合的生物学响应 |
| 3 本章小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 丝素蛋白材料在生物医学领域的应用研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（10）人脐带间充质干细胞外泌体对肌腱修复的作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 肌腱结构 |
| 1.2 肌腱愈合 |
| 1.3 肌腱粘连 |
| 1.4 外泌体 |
| 2 研究现状 |
| 2.1 促进肌腱愈合及预防肌腱粘连的主要策略 |
| 2.1.1 保守治疗 |
| 2.1.2 手术治疗 |
| 2.1.3 组织工程 |
| 2.2 外泌体和骨组织相关的研究进展 |
| 3 总结 |
| 第二章 人脐带间充质干细胞外泌体促进肌腱愈合 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验仪器、设备和软件 |
| 2.5 实验试剂配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 外泌体的分离和表征 |
| 3.2 细胞培养与处理 |
| 3.3 流式细胞术 |
| 3.4 天狼星红染色 |
| 3.5 WESTERN BLOT |
| 3.6 实时荧光定量 PCR (q-PCR) |
| 3.7 大鼠肌腱缺损模型 |
| 3.8 MIRNA测序 |
| 3.9 组织学染色和评估 |
| 3.10 免疫组织化学和细胞免疫荧光 |
| 3.11 生物力学测试 |
| 3.12 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 HUMSC-EXOS和 TDSC的鉴定和表征 |
| 4.2 HUMSC-Exos 促进了 TDSC 细胞增殖和促进肌腱标志物的表达 |
| 4.3 HUMSC-EXOS加速大鼠肌腱愈合 |
| 4.4 MIRNA测序分析 |
| 4.5 工程化 HUMSC-Exos 增强肌腱愈合 |
| 4.6 HUMSC-EXOS改善肌腱愈合相关通路的研究 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第三章 人脐带间充质干细胞外泌体抑制肌腱粘连 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验细胞 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验仪器、设备和软件 |
| 2.5 实验试剂配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养与处理 |
| 3.2 外泌体提纯 |
| 3.3 外泌体的表征 |
| 3.4 动物实验 |
| 3.5 免疫组织化学染色 |
| 3.6 细胞免疫荧光染色 |
| 3.7 MIRNA测序 |
| 3.8 细胞活力 |
| 3.9 WESTERN BLOT |
| 3.10 Q-PCR |
| 3.11 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 HUMSC-EXOS的表征 |
| 4.2 HUMSC-EXOS抑制大鼠成纤维细胞纤维化 |
| 4.3 HUMSC-EXOS缓解大鼠肌腱粘连 |
| 4.4 MIRNA测序分析 |
| 4.5 工程化HUMSC-EXOS增强对肌腱粘连的抑制作用 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第四章 羟基喜树碱通过诱导内质网应激依赖性凋亡抑制肌腱粘连 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验细胞 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验仪器、设备和软件 |
| 2.5 实验试剂配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 动物造模、处理与取材 |
| 3.2 细胞培养和处理 |
| 3.3 羟脯氨酸含量 |
| 3.4 免疫组织化学和免疫荧光 |
| 3.5 细胞增殖分析 |
| 3.6 流式细胞术 |
| 3.7 WESTERN BLOT |
| 3.8 Q-PCR |
| 3.9 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 HCPT抑制大鼠肌腱粘连 |
| 4.2 HCPT在体内诱导ERS,降低ECM沉积 |
| 4.3 HCPT 在抑制成纤维细胞增殖并诱导细胞凋亡 |
| 4.4 HCPT 在体外减轻 TGF-β1 诱导的纤维化 |
| 4.5 HCPT在体外激活ERS |
| 4.6 HCPT在体外对肌腱纤维化的抑制作用被SALUBRINAL阻断 |
| 4.7 HCPT通过激活PERK抑制肌腱纤维化 |
| 4.8 HCPT通过激活IRE1 抑制肌腱纤维化 |
| 4.9 HCPT通过激活ATF-6 抑制肌腱纤维化 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第五章 羟基喜树碱预处理的人脐带间充质干细胞外泌体抑制肌腱粘连 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验细胞 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验仪器、设备和软件 |
| 2.5 实验试剂配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养与处理 |
| 3.2 外泌体提纯与表征 |
| 3.3 细胞增殖与凋亡 |
| 3.4 细胞免疫荧光 |
| 3.5 Q-PCR |
| 3.6 WESTERN BLOT |
| 3.7 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 HUMSC-EXOS的表征 |
| 4.2 HCPT-EXOS抑制大鼠成纤维细胞增殖和促进细胞凋亡 |
| 4.3 HCPT-EXOS抑制肌腱纤维化 |
| 4.4 HCPT-EXOS增加ERS通路蛋白抑制成纤维细胞纤维化 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第六章 全文总结及展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 本课题的创新点与不足 |
| 3 今后工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
四、新一代ECM公司:New Interwoven（论文参考文献）
- [1]基于微服务架构和国密算法的高速公路收费认证平台设计[D]. 梁贞. 广西大学, 2021(12)
- [2]基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立[D]. 王宝剑. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]CGF对共培养人骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞促成骨成血管作用及相关机制研究[D]. 方悠然. 福建医科大学, 2021(02)
- [4]野百合碱与缺氧诱导的肺动脉高压蛋白质组学分析[D]. 钱红运. 福建医科大学, 2021(02)
- [5]青少年开角型青光眼的全外显子测序分析研究[D]. 陈智鑫. 汕头大学, 2021
- [6]Cinaciguat通过上调PKG2改善2型糖尿病大鼠种植体骨结合的作用效果及机制研究[D]. 贾婷婷. 山东大学, 2021
- [7]脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究[D]. 陈芳芳. 山东大学, 2021(10)
- [8]多孔聚醚醚酮微球的制备、表面改性及在骨修复中的应用[D]. 孙烁. 吉林大学, 2021(01)
- [9]松萝酸/丝素蛋白复合伤口敷料的制备及应用研究[D]. 查小英. 重庆医科大学, 2021(01)
- [10]人脐带间充质干细胞外泌体对肌腱修复的作用及相关机制研究[D]. 姚之肖. 上海交通大学, 2020(01)