黄连土壤微生物多样性及其酚酸降解菌筛选与降解机制

论文摘要

土壤微生物多样性是影响中药材生长的重要因素,而药材连续种植过程中由根系分泌的酚酸类化感物质对土壤微生物多样性有重要的影响。黄连是一种应用广泛的传统中药材,连作障碍严重限制了黄连的产量和品质,黄连种植土壤中的阿魏酸、对香豆酸、原儿茶酸等酚酸浓度呈逐年增加趋势,这种酚酸的积累被认为是导致黄连连作障碍的主要原因,然而酚酸对黄连土壤微生物多样性的影响尚不明确。随着高通量测序技术在土壤微生物多样性研究中的应用,系统性分析土壤微生物随环境因素的变化变为可能。此外,自然环境中酚酸降解过程非常缓慢,从黄连种植土壤中筛选高效酚酸降解菌株,阐明其降解机理,将为酚酸的生物降解和微生物多样性的恢复奠定基础。目的:采用高通量测序技术分析重庆石柱县不同种植年份的正茬/连作黄连根际土壤微生物群落结构的变化,研究种植黄连对微生物多样性和土壤理化因子的影响。同时结合培养法,分离黄连种植土壤中的微生物,筛选出能够高效降解酚酸的菌株,解析降解途径并阐明相关基因的功能。方法:1.检测土壤理化指标并提取黄连根际土壤微生物总DNA,对16S/ITS扩增子进行高通量测序。对测序结果进行聚类分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、微生物与环境因子的关联性分析,研究不同种植模式和种植年限下土壤微生物的群落结构动态变化。2.采用培养法分离黄连根际土壤微生物,筛选能以酚酸为唯一碳源够生长的微生物,并通过16S/ITS测序进行种属鉴定。高效液相色谱法检测这些菌株的酚酸降解能力,研究底物种类、碳源浓度、培养时间、土壤环境对阿魏酸降的影响。3.利用二代测序技术测定降解菌S.olivochromogenes A035基因组框架图后,BLAST比对分析其中酚酸降解相关基因,使用实时荧光定量PCR检测该菌株中阿魏酸降解相关基因的表达量。4.构建S.olivochromogenes A035的fcs/ech敲除株,确定其在阿魏酸分解代谢中的作用。在大肠杆菌中异源表达fcs/ech所编码的阿魏酰辅酶A合成酶（FCS）和烯酰辅酶A缩醛酶（ECHA）,体外酶活试验测定这两个酶对阿魏酸的降解活性。结果:1.扩增子测序结果显示,随着种植年限增加土壤微生物丰度发生明显变化,连作第五年的土壤中细菌的多样性最高,真菌多样性先降低后升高。其中酸杆菌门（Acidobacteria）、被孢霉属（Mortierella）、子囊菌门（Ascomycota）等丰度随种植年限增加而升高。β多样性分析显示随着黄连种植年限的增加土壤中微生物相异系数向0趋近。土壤理化指标显示黄连种植土壤pH偏低,种植年限较长的土壤中微生物与土壤有机质、碱解氮的含量呈正相关。筛选得到的阿魏酸高效降解菌的绝对丰度在正茬/连作土壤中均在第五年时最高。2.从黄连根际土壤微生物中共筛得酚酸降解菌14株,其中阿魏酸降解效率较高的1株真菌和4株放线菌分别鉴定为齿孢青霉（Penicillium daleae）、橄榄色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes）、赤色链霉菌（Streptomyces aurantiacus）和诺卡氏菌（Nocardia）。进一步检测其中Penicillium daleae F-0056和Streptomyces olivochromogenesA035这两株菌对阿魏酸的降解特性,发现外源阿魏酸添加量为200μg/ml时,菌株P.daleae F-0056培养72 h时阿魏酸降解率达87.5%,土壤环境下P.daleae F-0056在第6天时对阿魏酸的降解效率达71.8%。S.olivochromogenes A035则具有降解阿魏酸、肉桂酸、苯甲酸、香草酸、对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、原儿茶酸等多种酚酸的能力,土壤中加入该菌后的阿魏酸降解效果明显优于原始土壤,第24天时土壤中阿魏酸被完全降解。3.与菌株具有广谱酚酸降解能力相一致,S.olivochromogenes A035基因组含有编码辅酶A连接酶、辅酶A缩醛酶、苯甲酸双加氧酶、原儿茶酸双加氧酶等酚酸降解过程中关键酶的基因。阿魏酸为唯一碳源培养12h时,阿魏酸降解相关基因的表达量相对于在葡萄糖中生长时均显著上调,分解代谢关键基因fcs和ech表达量分别上调1033倍和1250倍。4.在E.coli BL21中异源表达FCS,纯化获得的目的蛋白能将底物阿魏酸转化为阿魏酰辅酶A,表明fcs基因在阿魏酸转化中起到重要作用。将FCS和ECHA两个酶同时在E.coli BL21中异源表达,获得的FCS/ECHA粗酶能够将底物阿魏酸分解并生成产物香草酸,提示S.olivochromogenes A035中阿魏酸降解与FCS/ECHA这两个酶有关。结论:以上结果表明黄连种植土壤呈酸性且土壤微生物组成与pH呈正相关,种植黄连的时间越长对土壤中微生物的群落结构影响越大,酚酸降解菌在黄连种植年份较长的土壤中富集。分离筛选得到酚酸降解菌S.olivochromogenes A035具有广谱的酚酸降解能力,可在土壤环境下高效降解阿魏酸。阿魏酸显著诱导该菌株中相关分解代谢基因的转录,表明该菌株是通过经典的阿魏酰辅酶A合成酶和烯酰辅酶A缩醛酶途径降解阿魏酸。本研究筛选得到多株可高效降解酚酸的微生物,丰富了酚酸降解菌资源库,并为黄连土壤微生物组学研究和黄连连作障碍的修复奠定基础。

论文目录

• 缩略语说明
• 摘要
• Abstract
• 第1章 综述
•   1.1 土壤微生物多样性概述
•     1.1.1 土壤微生物多样性研究的常用方法
•     1.1.2 中药材种植中的土壤微生物多样性
•     1.1.3 植物-土壤-微生物的互作
•   1.2 土壤中酚酸类化感物质研究现状
•     1.2.1 根系分泌物与酚酸类化感物质在土壤中的积累
•     1.2.2 酚酸对植物和微生物的化感作用
•   1.3 酚酸的生物降解途径及降解菌研究
•     1.3.1 酚酸的生物降解途径
•     1.3.2 阿魏酸生物降解相关基因
•     1.3.3 酚酸降解菌的应用
•   1.4 课题内容及研究意义
•     1.4.1 课题的提出
•     1.4.2 研究内容及技术路线
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 引物序列
•     2.1.3 黄连根际土壤样品
•     2.1.4 主要试剂及缓冲液配制方法
•     2.1.5 主要培养基及配制方法
•     2.1.6 仪器设备
•     2.1.7 生物信息学分析软件及网站
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 黄连土壤理化因子检测及其中微生物的分离纯化
•     2.2.2 DNA的提取
•     2.2.3 16S rRNA/ITS序列扩增和数据分析
•     2.2.4 筛选酚酸降菌
•     2.2.5 摇瓶试验检测阿魏酸降解菌的降解特性
•     2.2.6 土壤环境下F-0056/A035 对阿魏酸的降解效果
•     2.2.7 S.olivochromogenes A035 对几种酚酸的降解能力测试
•     2.2.8 S.olivochromogenes A035的RNA提取、纯化与反转录获得c DNA.
•     2.2.9 qPCR检测S.olivochromogenes A035 中各基因的表达量
•     2.2.10 制备大肠杆菌感受态
•     2.2.11 大肠杆菌质粒的提取
•     2.2.12 PCR反应体系
•     2.2.13 扩增片段及酶切载体的纯化
•     2.2.14 重组质粒的构建
•     2.2.15 S.olivochromogenes A035 遗传转化条件
•     2.2.16 蛋白表达纯化及功能验证
• 第3章 结果与分析
•   3.1 黄连根际土壤微生物群落多样性分析
•     3.1.1 黄连根际土壤微生物的OTU统计
•     3.1.2 不同种植年限土壤微生物的Alpha多样性分析
•     3.1.3 不同种植年限土壤微生物的Beta多样性分析
•     3.1.4 黄连土壤微生物与环境因子的关联性分析
•   3.2 不同年份黄连根际土壤微生物组成的动态变化
•     3.2.1 黄连根际土壤中细菌的群落动态变化
•     3.2.2 黄连根际土壤中真菌的群落动态变化
•   3.3 黄连根际土壤中的酚酸降解菌筛选
•     3.3.1 培养法获得的黄连根际土壤微生物
•     3.3.2 酚酸降解真菌的筛选及其对酚酸的降解特性
•     3.3.3 酚酸降解放线菌的筛选及其对酚酸的降解特性
•   3.4 S.olivochromogenes A035 全基因组测序及基因分析
•     3.4.1 S.olivochromogenes A035 全基因组测序
•     3.4.2 S.olivochromogenes A035 中酚酸降解相关基因分析
•     3.4.3 阿魏酸降解相关基因及其在S.olivochromogenes A035 中的转录
•   3.5 fcs/ech的功能研究
•     3.5.1 S.olivochromogenes A035 遗传转化体系及fcs/ech敲除株的构建
•     3.5.2 FCS/ECHA蛋白表达及纯化
•     3.5.3 FCS/ECHA体外转化阿魏酸
• 第4章 讨论
•   4.1 黄连根际土壤微生物多样性
•   4.2 来自于黄连土壤的酚酸降解菌及其降解特性
•   4.3 S.olivochromogenes A035 的阿魏酸降解机制
• 第5章 总结与展望
•   5.1 小结
•   5.2 创新点
•   5.3 不足与展望
• 参考文献
• 硕士期间科研成果及获奖情况
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘云露

导师: 胡昌华

关键词: 黄连,扩增子测序,土壤微生物,酚酸,阿魏酸降解菌

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,农艺学

单位: 西南大学

分类号: S154.3

总页数: 98

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