多形拟杆菌肝素酶Ⅰ的SUMO融合表达及酶学特性分析

论文摘要

【目的】克隆多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron） HeparinaseⅠ基因,在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行基因工程表达获得重组酶SUMO-Bt-HepI和Bt-HepI,并研究其酶学特性。【方法】对B.thetaiotaomicron肝素酶I （Bt-HepI）的基因序列进行密码子优化,PCR扩增得到目的基因,构建表达载体pET-28a-Bt-HepⅠ和pE-SUMO-Bt-HepⅠ,并转化至E.coliRosetta（DE3）进行表达,分别得到重组产物Bt-HepⅠ和SUMO-Bt-HepⅠ,以肝素钠为底物研究两者的酶学性质。【结果】SDS-PAGE检测显示Bt-HepⅠ和SUMO-Bt-HepⅠ的分子量大小分别约为42.5 kDa和55 kDa。与Bt-HepI相比,融合SUMO-Tag后的肝素酶I比酶活提高了48.9%。酶学性质表明:Bt-HepⅠ和SUMO-Bt-HepⅠ的最适pH和温度均为pH 9、45°C,二者在pH 5–9都具有很好的稳定性,但pH<5时,SUMO-Bt-HepI的耐酸性明显高于Bt-HepI。同时,在温度低于50°C时,SUMO-Bt-HepⅠ的比酶活高于Bt-HepⅠ。此外,Ca2+和Mg2+对重组肝素酶I具有明显的促进作用,而Cu2+、Mn2+、Zn2+则表现出一定的抑制作用,提示在多形拟杆菌肝素酶I的结构中除了存在已知的Ca2+结合位点外,可能还存在Mg2+的结合位点。【结论】本研究首次将多形拟杆菌来源的肝素酶I和SUMO-Tag进行了融合表达,使其比酶活得到了显著的提高,为其生产应用奠定了基础。

论文目录

• 1 材料和方法
•   1.1 菌种和载体
•   1.2 主要试剂和酶
•   1.3 多形拟杆菌肝素酶I的基因扩增
•   1.4 表达载体的构建
•   1.5 重组肝素酶I的外源表达、纯化和脱盐
•   1.6 酶活力的测定
•   1.7 重组肝素酶I的酶学特性研究
•     1.7.1 重组酶的最适pH及pH稳定性测定:
•     1.7.2 重组酶的最适温度及温度稳定性测定:
•     1.7.3 二价金属离子对酶活的影响:
• 2 结果和分析
•   2.1 重组酶表达载体的构建
•   2.2 重组酶的表达、纯化和脱盐
•   2.3 重组Bt-Hep I和SUMO-Bt-HepI的比酶活分析
•   2.4 重组表达产物的酶学特性研究
•     2.4.1 重组表达产物的最适pH及pH稳定性测定:
•     2.4.2 重组表达产物的最适温度及温度稳定性测定:
•     2.4.3 金属离子对酶活的影响:
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 张川,张悦,丁啸虎,李中媛,宋亚囝,罗学刚

关键词: 多形拟杆菌,肝素酶,融合表达,酶学性质

来源: 微生物学报 2019年07期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程国家级实验教学示范中心

基金: 国家重点研发计划(2017YFD0400303),国家“863计划”(2012AA021505)~~

分类号: Q936;Q78

DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20180387

页码: 1318-1330

总页数: 13

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