巴基斯坦传染性法氏囊病病毒分子流行病学研究

论文摘要

传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的严重危害家禽的最重要的免疫抑制病之一,也影响食品安全的可持续发展。家禽业是巴基斯坦的第二大产业,而IBD严重威胁家禽的健康养殖。尽管实施了大规模和高强度的疫苗免疫,IBD在包括巴基斯坦在内的全球许多国家仍然持续存在。然而,在某种程度上,巴基斯坦的IBDV优势流行株和流行模式尚不清楚,甚至在GenBank中找不到巴基斯坦IBDV毒株的的完整基因组信息。所以,很有必要开展巴基斯坦IBDV流行病学研究以揭示免疫失败的原因,以及为抗原匹配度更高的疫苗筛选和创制提供参考。IBDV是无囊膜病毒,其基因组是线性双股双节段RNA,A节段长约3.2 kb,B节段长约2.8 kb。基因组A节段有两个开放阅读框（ORF）,ORF1编码VP5蛋白,ORF2编码多聚蛋白PP。PP会被进一步酶解为VP2、VP3、VP4。VP2是病毒主要的结构蛋白、毒力蛋白和保护性抗原。B节段编码具有RNA依赖的RNA聚合酶活性（RdRp）的VP1蛋白。在本研究中,我们开展了一项流行病学调查,涵盖了2017年至2018年巴基斯坦家禽主要养殖区（旁遮普省、信德省、俾路支省和首都伊斯兰堡地区）的29个鸡群。RT-PCR结果显示,87%的检测样品均显示IBDV阳性。对37个IBDV毒株的VP2和VP1基因代表性区段进行了扩增和序列分析。VP2和VP1基因分别是IBDV基因组两个节段的代表性基因,其序列分析对于IBDV的遗传演化分析非常重要。在本研究之前,仅有少量的巴基斯坦毒株的VP2基因的部分片段被报道,VP1基因未见报道。本研究揭示了巴基斯坦IBDV的分子特征。独特的节段重配IBDV（vv-A/Uniq-B）首次被鉴定为巴基斯坦IBDV的优势流行毒株。vv-A/Uniq-B型节段重配IBDV的基因组A节段源自IBDV超强毒（vvIBDV）,而B节段来自一个未知的独特的（unique）祖先。为了深入解析巴基斯坦IBDV优势毒株的流行特征,采自巴基斯坦旁遮普省、信德省、俾路支省和首都伊斯兰堡等不同地方6个IBDV毒株（PK2,PK12,PK19,PK28,PK33和PK47）被分离鉴定,克隆并测定了其全长基因组。这是GenBank中第一批巴基斯坦IBDV毒株的全长基因组序列。基因组层面的分析进一步证实了巴基斯坦IBDV优势流行毒株是独特的节段重配病毒（vv-A/Uniq-B）,该类病毒形成独特分子,具有明显的地域特征。基于SPF鸡的动物试验显示,巴基斯坦IBDV均导致高发病率和高死亡率。本研究较清楚地揭示了巴基斯坦IBDV的主要流行特征。为了进一步了解目前所用疫苗与巴基斯坦IBDV流行毒株的抗原匹配性,本研究运用SPF鸡对两种疫苗的保护效果进行了评估。攻毒保护试验显示,所用疫苗可以对巴基斯坦IBDV的致死性攻击提供临床保护。此外,本研究进行的一项问卷调查研究发现,疫苗抗原匹配度、生物安全和饲养管理等多种因素均可能影响疫病的防控效果。本研究开展了覆盖巴基斯坦主要养禽地区的IBDV流行病学调查。首次克隆、确定和分析了覆盖IBDV基因组两个节段的巴基斯坦IBDV毒株基因和基因组。具有明显地域特征的独特的节段重配IBDV（vv-A/Uniq-B）首次被鉴定为巴基斯坦的IBDV优势流行毒株。巴基斯坦流行毒株引起较高的发病率和致死率。选择的疫苗可以对巴基斯坦IBDV的致死性攻击提供临床保护,饲养管理等多种因素均可能影响疫病的综合防控效果。

论文目录

• 摘要
• abstract
• Abbreviations
• Chapter 1 Introduction
•   1.1 Infectious bursal disease（IBD）
•     1.1.1 Overview of IBD
•     1.1.2 Epidemiology of IBD
•   1.2 Infectious bursal disease virus（IBDV）
•     1.2.1 Classification and morphological structure
•     1.2.2 Genomic structure
•     1.2.3 Evolution of IBDV
•     1.2.4 Coding Proteins
•       1.2.4.1 VP1
•       1.2.4.2 VP2
•       1.2.4.3 VP3
•       1.2.4.4 VP4
•       1.2.4.5 VP5
•   1.3 Reassortment of IBDV
•     1.3.1 vv-A/ Att-B
•     1.3.2 Att-A/ vv-B
•     1.3.3 vv-A/ c-B
•     1.3.4 vv-A/ var-B
•     1.3.5 vv-A/ II-B:
•     1.3.6 vv-A/ Uniq-B
•   1.4 Diagnosis of IBD
•     1.4.1 Clinical diagnosis
•     1.4.2 Laboratory diagnosis
•       1.4.2.1 RT-PCR
•       1.4.2.2 qRT-PCR
•       1.4.2.3 LAMP
•       1.4.2.4 RFLP
•       1.4.2.5 AGPT
•       1.4.2.6 ELISA
•       1.4.2.7 Histopathology assay
•   1.5 Vaccine of IBD
•     1.5.1 Inactivated vaccines:
•     1.5.2 Attenuated live vaccines
•     1.5.3 Immune complex vaccines
•     1.5.4 Live vector vaccines
•     1.5.5 DNA vaccine
•     1.5.6 Subunit vaccine
•   1.6 Poultry industry and avain disease in Pakistan
•     1.6.1 Poultry industry in Pakistan
•     1.6.2 Avian disease threat in Pakistan
•     1.6.3 National policy for healthy breeding
•   1.7 IBD in Pakistan
•     1.7.1 Threat of IBD in Pakistan
•     1.7.2 Epidemiology of IBD in Pakistan
•     1.7.3 Control of IBD in Pakistan
•     1.7.4 Problems in IBD control in Pakistan
•   1.8 Research purpose and significance
• Chapter 2 Detection and genetic evolution analysis of IBDV in Pakistan
•   2.1 Materials and methods
•     2.1.1 Key reagents and instruments
•     2.1.2 Primers
•     2.1.3 Clinical samples
•     2.1.4 RT-PCR detection
•     2.1.5 Amplification and sequencing of VP
•     2.1.6 Amplification and sequencing of VP
•     2.1.7 Sequencing
•     2.1.8 Sequence analyses
•   2.2 Results
•     2.2.1 IBDV detection
•     2.2.2 Molecular characterization of VP2 of Pakistan strains
•     2.2.3 Molecular characterization of VP1 of Pakistan isolates
•     2.2.4 Phylogeny analysis
•   2.3 Discussion
•     2.3.1 IBD infections are widespread in Pakistan
•     2.3.2 The reassortant IBDVs（vv-A/Uniq-B）with regional characters are the predominant strains in Pakistan
• Chapter 3 Virus isolation and biological character identification of Pakistan IBDVs
•   3.1 Materials and methods
•     3.1.1 Key reagents and instruments
•     3.1.2 Primers
•     3.1.3 SPF embryonated eggs and chickens
•     3.1.4 Virus isolation
•     3.1.5 Virus purity detection
•     3.1.6 Virus titration
•     3.1.7 Viral genome clone
•       3.1.7.1 Segment A clone
•       3.1.7.2 Segment B clone
•     3.1.8 Genome sequence analysis
•     3.1.9 Animal experiments
•     3.1.10 Statistical analysis
•   3.2 Results
•     3.2.1 Virus isolation and identification
•     3.2.2 Clone and determination of the complete genome
•     3.2.3 Virus genome sequence analysis
•       3.2.3.1 Molecular characterization of segment A of Pakistan IBDVs
•       3.2.3.2 Molecular characterization of segment B of Pakistan IBDVs
•       3.2.3.3 Phylogeny analysis
•     3.2.4 Pathogenicity of Pakistan IBDVs
•       3.2.4.1 Pathogenicity of PK2 strain
•       3.2.4.2 Pathogenicity of other Pakistan IBDVs
•   3.3 Discussion
•     3.3.1 The full-length genome analysis further confirmed the unique reassortant characteristics of Pakistan IBDVs
•     3.3.2 Pakistan reassortant IBDVs showed high pathogenicity
• Chapter 4 Evaluation of vaccines against Pakistan IBDVs
•   4.1 Materials and methods
•     4.1.1 Key reagents and instruments
•     4.1.2 SPF chickens
•     4.1.3 IBD vaccines
•     4.1.4 Challenge protection experiment
•     4.1.5 Statistical analysis
•   4.2 Results
•     4.2.1 Clinical observation
•     4.2.2 Postmortem
•     4.2.3 Body weight
•   4.3 Discussion
•     4.3.1 Vaccines available can provide clinical protection against Pakistan IBDVs
•     4.3.2 Various factors might be involved in avian disease in immunized chicken flocks
• Chapter 5 Conclusion
• References
• Attachment
• Acknowledgement
• Author Biography

文章来源

类型: 博士论文

作者: ALTAF HUSSAIN

导师: 祁小乐

关键词: 传染性法氏囊病病毒,流行病学,基因组,保护,巴基斯坦

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: the National Key Research and Development Program of China (No.2016YFE0203200,No.2017YFD0500704),the Major Project of National Natural Science Foundation of China (No.31430087),the Modern Agro-industry Technology Research System (No.CARS-41-G15).

分类号: S852.65

总页数: 99

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