浒苔中谷胱甘肽转移酶家族的功能研究

论文摘要

从2007年以来,黄海绿潮已经连续爆发了十二年,对海洋生态环境和沿岸居民生活造成了极大的危害和经济损失。研究表明,石莼属的浒苔是黄海绿潮优势种。优势种通过表现出对广泛的辐照度、温度和盐度的明显适应性,或对各种环境条件的生理适应性,从而获得竞争优势。植物抗氧化系统的特征之一就是通过提高自身对环境的耐受性从而表现出广温、广盐等生长特征。浒苔具有广温、广盐的生长特征,因此,我们从植物抗氧化胁迫方面入手,选取了抗氧化系统重要成员谷胱甘肽转移酶（GST）。通过研究谷胱甘肽转移酶在浒苔中的表达情况以确定浒苔中的谷胱甘肽转移酶是否参与抗氧化胁迫从而提高浒苔对逆境环境的耐受性。谷胱甘肽转移酶是一类在生物体中广泛存在的蛋白质超家族,在解毒抗逆方面具有重要作用,但是之前有关GST的研究主要集中在动物和高等植物,藻类中的研究较少,有关浒苔中GST的研究还未见报道。本研究以浒苔为研究对象,在获得GST基因序列后,通过对基因和蛋白序列进行生物信息学分析,对蛋白进行表达纯化和酶活测定等方法,对浒苔GST基因家族进行了分子进化、基因表达和蛋白功能分析,获得了如下结果:1.浒苔GST基因克隆:通过基因克隆我们得到了 5个浒苔GST基因:UpGST1,UpGST2,UpGST3,UpGST4,UpGST5。氨基酸大小分别为220,222,242,156和244 aa。2.GST生物信息学分析:我们使用了多种生物信息学分析工具对GST的氨基酸序列的基本理化性质、保守结构域、蛋白质的高级结构等进行了分析。结果表明UpGST1、UpGST2、UpGST3、UpGST5都为脂溶性亲水蛋白,无跨膜结构域和信号肽,分别具有19、20、24、15个磷酸化位点。UpGST4为脂溶性疏水蛋白,含有3个跨膜结构域,与其它GST一样不具有信号肽,具有13个磷酸化位点。经过对蛋白结构域的分析,发现UpGST1,UpGST2,UpGST3和UpGST5均具有可溶性谷胱甘肽转移酶特有的C末端和N末端结构域,证明其属于可溶性蛋白。UpGST4则具有MAPEG家族（微粒体谷胱甘肽转移酶）的结构域的特征,蛋白大小也与MAPEG家族蛋白大小相符,是156个氨基酸组成的小蛋白。3.原核表达分析:成功构建了pET28a-UpGST1,pET28a-UpGST2,pET28a-UpGST3的表达载体,经过IPTG诱导均获得表达,且表达条带大小与理论值相符。4.酶活测定:将诱导表达后的菌体超声破碎后过Ni柱纯化,得到重组融合蛋白,经过SDS-PAGE电泳检测后其大小与理论值相符。通过酶活测定,3个重组蛋白对1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）均具有活性,且活性较好。5.GST表达分析:以18s rDNA基因作为内参,通过qPCR分析了在高温、低温、高光、低光、高盐、低盐和高强度紫外辐射七个不同胁迫条件下的5个GST基因24 h表达情况。发现5个GST基因均有表达,且表达受胁迫条件诱导。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明及缩略词
• 第一章 绪论
•   1.1 黄海绿潮
•   1.2 浒苔
•     1.2.1 浒苔的进化地位
•     1.2.2 浒苔形态特征
•     1.2.3 浒苔繁殖方式
•   1.3 谷胱甘肽转移酶
•     1.3.1 GST分类
•     1.3.2 GST的命名
•     1.3.3 GST的进化
•     1.3.4 植物GST功能
•     1.3.5 GST在生物技术领域的应用前景
•   1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 浒苔GST基因的克隆分析
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验样品
•     2.1.2 培养基
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 总RNA的提取
•     2.2.2 RNA反转录为cDNA
•     2.2.3 浒苔GST基因克隆
•     2.2.4 GST生物信息学分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 浒苔GST目的片段的扩增
•     2.3.2 浒苔GST基因的生物信息学分析
•   2.4 讨论
• 第三章 浒苔GST蛋白的功能研究
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌种和质粒
•     3.1.2 抗生素、生长素
•     3.1.3 试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 总RNA的提取
•     3.2.2 RNA反转录为cDNA
•     3.2.3 重组表达载体的构建
•     3.2.4 重组蛋白的原核表达
•     3.2.5 重组蛋白的纯化
•     3.2.6 纯化后蛋白浓度的测定
•     3.2.7 酶活的测定
•     3.2.8 浒苔GST基因的定量表达
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 浒苔GST基因表达载体的构建
•     3.3.2 重组蛋白的原核表达
•     3.3.3 重组蛋白的纯化
•     3.3.4 纯化后蛋白的浓度测定
•     3.3.5 酶活的测定
•     3.3.6 浒苔GST基因的定量表达
•   3.4 讨论
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 硕士研究生在读期间发表论文
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘兴凤

导师: 毕玉平,刘峰

关键词: 浒苔,基因克隆,酶活,表达分析

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山东大学

分类号: Q946.5

总页数: 101

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