布鲁氏菌真核及原核表达重组Omp10-Omp28-L7/L12亚基免疫效果的比较

论文摘要

布鲁氏菌是布鲁氏菌病的病原体。它可以造成牲畜和人类感染,并在流行区域引起恐怖的生物威胁。目前,一些布鲁氏菌减毒活疫苗被用于家畜免疫。然而,这些疫苗对人类是致病性的,在给怀孕的牲畜注射时会引发流产,并在接种疫苗的家畜中诱导抗体,干扰诊断。因此,提高针对布鲁氏菌疫苗的免疫保护效果和安全性至关重要。目前,重组蛋白亚单位疫苗被认为是预防布鲁氏菌病的有希望的新一代安全有效的替代品。在我们的研究试验中,我们经过毕赤酵母（P.pastoris）真核系统和大肠杆菌（E.coli）原核系统表达了布鲁氏菌的重组Omp10-Omp28-L7/L12蛋白,用重组蛋白作为免疫原来评价免疫应答。此外,我们研究小组发现并以免疫调节因子泰山松花粉多糖（Taishan pinus pollen polysaccharide,TPPPS）为佐剂研究其对免疫原的免疫调节作用。我们将小鼠分成4组,分别接种Omp10-Omp28-L7/L12（毕赤酵母表达产物）,Omp10-Omp28-L7/L12（毕赤酵母表达产物）+TPPPS,Omp10-Omp28-L7/L12（大肠杆菌表达产物）和磷酸盐缓冲液（PBS）。随后我们检测了抗体水平,脾淋巴细胞增殖,CD4+和CD8+T细胞的数目以及细胞因子分泌并且用攻毒保护试验来评估各疫苗的免疫效果。实验结果分析表明,接种Omp10-Omp28-L7/L12重组蛋白组的免疫效果显著高于PBS对照组。此外,在巴斯德毕赤酵母中表达的重组Omp10-Omp28-L7/L12亚单位疫苗表现出比在大肠杆菌中表达的更高的免疫原性。另外,TPPPS被证明是重组Omp10-Omp28-L7/L12亚单位疫苗的良好免疫增强剂。因此,重组Omp10-Omp28-L7/L12亚基与TPPPS佐剂结合,显示出作为预防布鲁氏菌病的有效布鲁氏菌疫苗的潜力。设计Omp10-Omp28-L7/L12融合基因序列并由金唯智公司进行密码子优化合成融合基因,将PCR扩增得到的融合蛋白基因与克隆质粒pMD18-T载体结合,将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α菌株中以增大产量。将验证正确的pET-28a（+）-Omp10-Omp28-L7/L12大肠杆菌转化体以及空白表达质粒pET-28a（+）加入IPTG培养,37℃振荡培养至6 h,并在IPTG诱导后1、3、5和6 h取菌液,4℃离心,收集菌体裂解产物。并制作了Omp10、Omp28和L7/L12的多克隆抗体以作为后续实验材料。将验证正确的pPIC9-Omp10-Omp28-L7/L12以及空白表达质粒pPIC9转入至巴斯德毕赤酵母中并由甲醇诱导蛋白质表达,在甲醇诱导完成的24、48、72和96 h通过离心收获培养物上清液。利用SDS-PAGE以及Western Blot印迹分析鉴定,经分析,在蛋白凝胶层析中出现了分子大小是55.4 kDa的目标条带,而且空白对照孔是没有出现这样的条带。试验证明了在阳性孔中出现的条带大小和我们的目标蛋白是一致的。Western Blot检测出了同样大小的条带,和SDS-PAGE中检测到的相符。将表达蛋白进行镍柱纯化,之后再用SDS-PAGE检测,此时,在检测结果中只有大小是55.4kDa的单一目标条带。把纯化的Omp10-Omp28-L7/L12蛋白与我们实验室制作的松花粉多糖以1:1比率混匀制成蛋白疫苗。将120只5-6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为4组,每组有30只,并喂养在相同的饲养条件中。I-IV组中的所有小鼠分别皮下接种纯Omp10-Omp28-L7/L12（毕赤酵母表达产物）,Omp10-Omp28-L7/L12（毕赤酵母表达产物）+TPPPS,纯Omp10-Omp28-L7/L12（大肠杆菌表达产物）和PBS,并在接种后第7 d和第14 d加强免疫。在接种后的0、14、28、42和56 dpv时,在每个分组中随机选择5只小鼠采血再分别通过流式细胞技术、MTT检测方法和ELISA检测技术、以评估相关免疫指标。主要检测外周血CD4+与CD8+比例、T淋巴细胞的转化率、血清抗体水平和IL-2、IFN-γ分泌水平这些免疫指标。还用攻毒保护试验来评估各疫苗的免疫效果。检测后显示由真核毕赤酵母表达的Omp10-Omp28-L7/L12重组蛋白促进小鼠分泌特异性抗体水平高于由原核大肠杆菌表达的Omp10-Omp28-L7/L12重组蛋白,而且,也显示了佐剂松花粉多糖显著增强了小鼠免疫应答水平。研究结果为提高布鲁氏菌亚单位疫苗的免疫效力提供了新的前景。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
•   1.1 布鲁氏菌病简介
•     1.1.1 布鲁氏菌形态结构和分型
•     1.1.2 布鲁氏菌培养特性
•     1.1.3 主要布鲁氏菌蛋白及其功能
•     1.1.4 流行病学
•     1.1.5 布鲁氏菌病的诊断与防治
•       1.1.5.1 诊断
•       1.1.5.2 防治
•   1.2 亚单位疫苗与融合蛋白表达系统概述
•     1.2.1 布鲁氏菌亚单位疫苗简述
•     1.2.2 融合蛋白表达系统选择
•     1.2.3 毕赤酵母简述及其常见宿主菌株
•     1.2.4 毕赤酵母诱导表达
•     1.2.5 大肠杆菌简述及其常见宿主菌株
•     1.2.6 大肠杆菌诱导表达
•   1.3 松花粉多糖研究概述
•     1.3.1 多糖研究概况
•     1.3.2 多糖的生物活性
•     1.3.3 松花粉多糖研究现状
•   1.4 本研究目的及意义
• 2 材料和方法
•   2.1 菌株和质粒
•   2.2 试剂和仪器
•   2.3 OMP10-OMP28-L7/L12大肠杆菌重组阳性转化子的构建
•     2.3.1 重组OMP10-OMP28-L7/L12基因合成及扩增
•     2.3.2 重组OMP10-OMP28-L7/L12基因克隆及测序
•     2.3.3 重组PET28A-OMP10-OMP28-L7/L12重组表达载体的构建
•     2.3.4 大肠杆菌阳性转化子的构建
•   2.4 OMP10-OMP28-L7/L12融合蛋白诱导大肠杆菌原核表达、鉴定及纯化
•     2.4.1 OMP10-OMP28-L7/L12融合蛋白的表达及获取
•     2.4.2 OMP10-OMP28-L7/L12融合蛋白SDS-PAGE和WESTERN BLOT分析
•     2.4.3 OMP10-OMP28-L7/L12融合蛋白纯化及含量测定
•   2.5 OMP10-OMP28-L7/L12毕赤酵母重组阳性转化子的构建
•     2.5.1 重组OMP10-OMP28-L7/L12基因扩增
•     2.5.2 重组OMP10-OMP28-L7/L12基因克隆及测序
•     2.5.3 PPIC9-OMP10-OMP28-L7/L12重组表达载体的构建
•     2.5.4 重组PPIC9-OMP10-OMP28-L7/L12质粒线性化
•     2.5.5 毕赤酵母阳性转化子的构建
•   2.6 OMP10-OMP28-L7/L12融合蛋白诱导毕赤酵母真核表达、鉴定和纯化
•     2.6.1 OMP10-OMP28-L7/L12融合蛋白的表达及获取
•     2.6.2 OMP10-OMP28-L7/L12融合蛋白SDS-PAGE和WESTERN BLOT分析
•     2.6.3 OMP10-OMP28-L7/L12融合蛋白纯化和含量测定
•   2.7 松花粉多糖对OMP10-OMP28-L7/L12融合蛋白免疫增强效果的研究
•     2.7.1 免疫原制备
•     2.7.2 动物试验
•       2.7.2.1 血清抗体水平检测
•       2.7.2.2 细胞因子分泌水平检测
• +、CD8⁺ T淋巴细胞含量测定'>      2.7.2.3 外周血CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞含量测定
•       2.7.2.4 外周血淋巴细胞转化率检测
•       2.7.2.5 免疫保护试验
•     2.7.3 数据分析
• 3 结果与分析
•   3.1 OMP10-OMP28-L7/L12大肠杆菌重组阳性转化子的构建
•   3.2 OMP10-OMP28-L7/L12融合蛋白诱导大肠杆菌原核表达、鉴定及纯化
•   3.3 OMP10-OMP28-L7/L12毕赤酵母重组阳性转化子的构建
•   3.4 OMP10-OMP28-L7/L12融合蛋白诱导毕赤酵母真核表达、鉴定和纯化
•   3.5 松花粉多糖增强重组融合蛋白免疫效果的研究
•     3.5.1 血清抗体水平的测定
•     3.5.2 细胞因子分泌水平的测定
• +、CD8⁺淋巴细胞含量的变化'>    3.5.3 外周血CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞含量的变化
•     3.5.4 外周血淋巴细胞转化率的变化
•     3.5.5 重组蛋白免疫保护作用
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文
• 个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱琳

导师: 朱瑞良

关键词: 布鲁氏菌,亚单位疫苗,毕赤酵母,重组蛋白,佐剂

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 国家重点研发计划(2017YFD0500706),山东省现代农业产业技术体系羊产业创新团队建设项目(SDAIT-10-06),山东省“双一流”奖补资金(SYL2017YSTD11)

分类号: S852.614

总页数: 67

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