宋敏丁银环向成玉黄丽
泸州医学院附属医院检验科四川泸州646000
【摘要】目的通过筛选氨基糖苷耐药铜绿假单胞菌的特异蛋白，为研究氨基糖苷耐药铜绿假单胞菌耐药机制奠定基础。方法收集本院2011年9月-2012年6月临床分离的82株铜绿假单胞菌，并根据药敏情况将菌株分为氨基糖苷耐药组和氨基糖苷敏感组。采用SELDI-TOFMS技术筛选出两组的差异蛋白峰，查阅Swiss-prot蛋白数据库初步鉴定差异蛋白。结果共筛选4个蛋白峰表达最具差异，质荷比分别为10372.87、9900.02、9101.25、7600.04。结论氨基糖苷耐药铜绿假单胞菌和氨基糖苷敏感铜绿假单胞菌蛋白表达存在差异，这些蛋白对氨基糖苷耐药机制的研究具有重要的意义。
【关键词】表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术；耐药；铜绿假单胞菌
Applicationofspecificproteinsforaminoglycoside-resistantpseudomonasaeruginosa
SONGMin，DINGYin-huan，XIANGCheng-yu，HUANGLi，
（DepartmentofLaboratoryMedicine，TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege，Luzhou646000，China）
【Abstract】Objective：Toscreenspecificproteinforaminoglycoside-resistantpseudomonasaeruginosa，andlaythefoundationforthestudyofresistancemechanismsforaminoglycoside-resistantpseudomonasaeruginosa.Methods：FromSeptember2011toJune2012，atotalof82strainsofpseudomonasaeruginosaisolatedfromclinicalspecimenswerepidedintoaminoglycoside-resistantgroupandaminoglycoside-sensitivegroupbasedonsusceptibilitytest.DifferentproteinpeakswereselectedbySELDI-TOFMStechnologybetweenthetowgroups，andpreliminaryidentificatedinSwiss-protproteindatabase.Results：Fourproteinpeakswhichwere9900.02、7600.04、9101.25and10372.87werefoundexpressingsignificantlydifferentially.Conclusions：Proteinsexpresseddifferentlybetweenaminoglycoside-resistantgroupandaminoglycoside-sensitivegroup.Theseproteinshadimportantsignificanceforthestudyofaminoglycosideresistancemechanisms
【Keywords】Surfaceenhancedlaserdesorption/ionization-timeofflightmassspectrometrytechnology；resistance；pseudomonasaeruginosa
[中图分类号]R977.1+3[文献标识码]A[文章编号]1672-5018（2016）01-084-02
铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa，PAE）是医院感染的主要病原菌之一。近些年来，随着抗菌药物的广泛使用，由铜绿假单胞菌引起的医院感染比例明显上升。卫生部全国细菌耐药监测网显示，2011年铜绿假单胞菌临床分离率在非发酵菌中位居第一[1]。氨基糖苷耐药铜绿假单胞菌的流行和传播使铜绿假单胞菌的控制变得愈加困难。本研究拟从蛋白组学的角度对本院临床分离的铜绿假单胞菌进行氨基糖苷类修饰酶耐药机制研究，旨在为临床合理使用抗菌药物，减少耐药菌株的产生，控制耐药菌株的流行提供科学依据。
1材料与方法
1.1菌株来源
收集我院2011年9月-2012年6月临床分离出的82株铜绿假单胞菌。
1.2菌株的鉴定及药敏
采用MicroScanWalkAway96SI全自动微生物鉴定/药敏测试系统进行菌株鉴定及药敏。根据药敏情况分为氨基糖苷类抗菌药物耐药组：对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素3种氨基糖苷类抗菌药物中至少一种耐药的菌株；氨基糖苷类抗菌药物敏感组：对以上3种氨基糖苷类抗菌药物均敏感的菌株。质控菌株为ATCC25922大肠杆菌和ATCC27853铜绿假单胞。
1.3检测差异蛋白
采用有机溶剂沉淀法[2]提取细菌蛋白质，将细菌蛋白提取液与等量的半饱和芥子酸（sinapinicacid，SPA）溶液振荡混匀后，取2µL样品混合液点加于活化的Au芯片芯池中央，室温干燥后再取1µL半饱和SPA点于芯池中央，室温干燥后采用PBSll/C型蛋白指纹图谱仪检测结合在AU芯片表面的蛋白。
1.4数据分析
采用BiomarkerWizard3.1软件筛选出氨基糖苷类耐药菌株组和氨基糖苷类敏感菌株组的差异蛋白质谱峰，用t检验比较两组菌株蛋白质峰值的差异，P<0.05的蛋白质峰差异具有统计学意义。在筛选出的差异蛋白峰中兼顾峰高度较高、P值较小、标准差值较小的原则，选择最具差异性的蛋白质。
1.5查阅Swiss-prot蛋白数据库初步鉴定差异蛋白
查阅Swiss-prot蛋白数据库，在分子量（Mw）项输入筛选的最具差异蛋白的相对分子质量数值，种类项输入“Pseudomonadales（假单胞菌目）”，质量范围设为0.1%。
2结果
2.1铜绿假单胞菌蛋白指纹图
本研究在质荷比2000-10000之间捕获到4个最具差异蛋白质峰，m/z分别是10372.87、9900.02、9101.25、7600.04。其中，m/z为10372.87、9101.25、7600.04的蛋白峰在氨基糖苷耐药菌株组表达上调，m/z为9900.02蛋白峰在氨基糖苷耐药菌株组表达下调。这4个蛋白质峰差异蛋白峰相对强度见表1
表1氨基糖苷类耐药菌株和氨基糖苷类敏感菌株差异蛋白质峰强度（±s）
3讨论
SELDI-TOFMS质谱技术是基于基质辅助激光解吸附及离子化（matrix–assistedlaserdesorption/ionization，MALDI）发展而来的一种新兴的蛋白组学技术。SELDI-TOFMS技术的主体是蛋白质芯片、飞行时间质谱仪和相关数据软件。其基本原理是：通过激光脉冲辐射使结合在芯片上的分析物发生离子化，根据这些离子质荷比不同，在质谱仪真空管内飞行到离子检测器的时间不同，由此捕获并绘制成质谱图，经相关数据软件处理形成模拟图谱，该图谱可直观显示捕获蛋白质的相对分子质量、含量、等电点等信息。SELDI-TOFMS技术近几年已广泛应用于病原微生物蛋白组学的研究，并且在病原微生物的鉴定、生物标志物的监测、致病机理、耐药机制、新型药物、潜在疫苗的研究上，取得了令人鼓舞的成果[3-7]。
通过病原菌蛋白质组学技术可以发现在抗菌药物的作用下，病原菌所表达的蛋白质发生了何种变化以及如何变化，从而为病原菌耐药机制的研究、流行病学的调查提供理论基础。谢贝等[8]对比分析单耐利福平（RFP）耐药分枝杆菌株与敏感分枝杆菌早、中期培养滤液中差异的蛋白质∕多肽，发现早、中期都存在差异蛋白∕多肽，有望从中筛选到RFP耐药的特异标志物。本研究发现4个最具差异的蛋白峰。其中，9900.02在氨基糖苷类耐药菌株的表达低于氨基糖苷类敏感菌株，对应的蛋白为核糖体蛋白主要调控细菌蛋白转录、翻译过程。7600.04在氨基糖苷类耐药菌株的表达高于氨基糖苷类敏感菌株，对应蛋白为冷休克蛋白CSPA。冷休克蛋白CSPA表达量增高，菌株对抗外界环境的能力强加，不可避免的增加了细菌的感染传播的机会。9101.25在氨基糖苷类耐药菌株的表达高于氨基糖苷类敏感菌株，对应蛋白为影响膜结构的膜蛋白插入效率因子。细菌膜蛋白在细菌耐药机制中起着重要的作用，如细菌外膜蛋白通道缺失、表达降低都将使抗菌药物难以达到作用靶点，从而产生耐药。膜蛋白插入效率因子对膜蛋白功能产生何种影响有待进一步研究。10372.87在氨基糖苷类耐药菌株的表达高于氨基糖苷类敏感菌株，对应的蛋白为调控细菌分裂的MinE蛋白。MinE蛋白包括两个功能结构域：N端的拮抗MinCD分裂抑制因子结构域，能够解除MinCD复合体与细胞膜的聚合；C端的拓扑专一结构域，能够识别存在于细胞中部和两极的潜在分裂位点。氨基糖苷类耐药菌株中高表达的MinE蛋白，可能导致菌株异常分裂，迫使耐药菌株难以控制。氨基糖苷类耐药铜绿假单胞菌的这些差异蛋白，与氨基糖苷类修饰酶基因的关系以及与耐药机制的明确关系有待进一步研究。
参考文献
[1]李耘，吕媛，郑波.卫生部全国细菌耐药监测网2011年度非发酵革兰阴性杆菌耐药监测[J].中国临床药理学杂志，2012，28（12）：883-887.
[2]AloushV，Navon-VeneziaS，Seigman-IgraY，etal.Multidrug-resistantPseudomonasaeruginosa：riskfactorsandclinicalimpact[J].AntimicrobAgentsChemother，2006，50（1）：43-8.
[3]DubskaL，PilatovaK，DolejskaM，etal.Surface-enhancedlaserdesorptionionization/time-of-flight（SELDI-TOF）massspectrometry（MS）asaphenotypicmethodforrapididentificationofantibioticresistance[J].Anaerobe，2011，17（6）：444-7.
[4]XiaoD，YangY，LiuH，etal.DevelopmentofamethodbasedonsurfaceenhancedlaserdesorptionandionizationtimeofflightmassspectrometryforrapididentificationofKlebsiellapneumoniae[J].JMicrobiol，2009，47（5）：646-50.
[5]PoonTC，HuiAY，ChanHL，etal.PredictionofliverfibrosisandcirrhosisinchronichepatitisBinfectionbyserumproteomicfingerprinting：apilotstudy[J].ClinChem，2005，51（2）：328-35.
[6]SeoGM，KimSJ，ChaiYG.RapidprofilingoftheinfectionofBacillusanthracisonhumanmacrophagesusingSELDI-TOFmassspectroscopy[J].BiochemBiophysResCommun，2004，325（4）：1236-9.
[7]XuP，AlamMM，KalsyA，etal.Simple，directconjugationofbacterialO-SP-coreantigenstoproteins：developmentofcholeraconjugatevaccines[J].BioconjugChem，2011，22（10）：2179-85.
[8]谢贝，谭守勇，刘健雄，等.单耐利福平结核分枝杆菌株早中期培养滤液蛋白质/多肽谱分析[J].国际医药卫生导报，2010，16（13）：1542-1545.