肠毒素性大肠杆菌的RFP基因特异性标记及表达研究

论文摘要

在益生菌的选育、体内效价评定以及作用机制研究中,建立肠道攻毒模型可以提供一种有效的手段,即采用特定的病原菌,建立其特异性标记和检测方法,用于体内示踪和分布的研究。常规的模型以绿色荧光蛋白标记及特异性检测居多,但存在菌株遗传稳定性差、检测特异性不强等问题,尤其受到体内背景荧光干扰大的影响,测定结果准确性不高。本研究以肠毒性大肠杆菌作为通用病原菌,采用红色荧光蛋白标记的方法,尝试应用不同的分子标记模式,拟构建出荧光表达稳定、特异性更强的荧光标记菌株,为进一步建立病原菌的攻毒模型奠定菌株和方法学基础。具体研究内容和相关结果如下:（1）选择红色荧光蛋白mKate和mCherry作为报告基因,分别连入3种常见表达载体pET-28a、pET-9a和pQE30,得到6种重组质粒并分别转化至感受态细胞TOP10中。在无诱导剂的条件下,成功筛选得到两种重组质粒pQE30-mKate,pQE30-mCherry,其转化菌株菌落呈现明显红色。以这两种重组质粒为基础,进一步分别化转到不同类型的肠毒性大肠杆菌细胞（E.coli K88ab、E.coli K88ac、E.coli K99和E.coli 987P）中,根据菌落颜色筛选阳性克隆,挑选单菌落用于荧光检测以及酶切验证。结果表明,与其他质粒和表达宿主相比,在无诱导剂的条件下,重组质粒pQE30-mCherry能够实现在E.coli K99中高效表达,过表达的mCherry可泄露至胞外,其阳性转化子在平板上呈现鲜亮的红色,在荧光显微镜下能观察到明显红色荧光。经PCR分子鉴定,荧光标记菌株毒性基因未丢失,并且生长特性无明显变化。通过建立标记菌株E.coli K99-mCherry活菌浓度与荧光强度的关系曲线（R2=0.9998）,细胞浓度的检测限达到103 CFU/mL。（2）为增强荧光检测的灵敏度,拟通过增加其mCherry的拷贝数的方式来提高菌株的荧光表达量。分别采用mCherry多拷贝表达盒和多拷贝串联体这两种方式,来构建mCherry基因的双拷贝重组菌质粒,并分别转化E.coli K99进行异源表达。结果表明与单拷贝的重组菌E.coli K99-mCherry相比较,双拷贝的重组菌E.coli K99-2×mCherry和E.coli K99-×2mCherry的荧光强度均低于E.coli K99-mCherry,故单拷贝的mCherry基因在E.coli K99中的表达效果是最好的。（3）本试验首先探讨采用表面展示mCherry基因标记肠毒性大肠杆菌的方法,即通过over-lap PCR方法融合Lpp和OmpA作为锚定蛋白,构成重组质粒pQE30-Lpp’OmpA-mCherry,然后转化到宿主菌E.coli K99。通过镜检、分子鉴定、生长特性分析以及荧光蛋白表达稳定性等方式来评价标记菌株。结果表明,重组菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry菌株毒性基因未丢失,生长特性无明显变化,菌体的生长与其荧光信号同步,而且荧光表达的遗传稳定性较高。在不诱导的情况下,能通过肉眼观察到红色阳性克隆,在荧光显微镜下也能观察到明显的红色荧光。表明本研究实现了外源蛋白mCherry在肠毒性大肠杆菌中的组成型表达。通过建立标记菌株E.coli K99-mCherry活菌浓度与荧光强度的关系曲线（R2=0.9997）,得到细胞浓度的检测限为104 CFU/mL。（4）本试验进一步基于CRISPR/Cas9基因编辑技术来实现mCherry在E.coli K99菌株中定点插入标记。以大肠杆菌K12基因序列为参照,选取可插入外源基因的假基因yheO位点。根据所选假基因位点序列设计sgRNA,成功构建pTargetF-sgRNA载体。并以假基因yheO为模板扩增出yheO的左右同源臂,通过设计引物利用重叠延伸PCR将T5启动子、目的基因mCherry、左右同源臂以及线性化片段J23119（Spe I）-sgRNA-gRNA scaffold相连,最后与Kpn I和Sph I双酶切线性化载体pUC57进行连接反应,构建含有外源基因mCherry的基因编辑载体Donor。将测序成功的Donor载体转化至E.coli K99-Cas9感受态中,挑选验证成功的阳性克隆加入诱导剂IPTG,30℃振荡培养过夜,在42℃条件下培养处理16h以去除基因编辑载体。结果表明,mCherry的定点敲入构建的菌株与野生菌株相比,生长特性无明显变化,毒性基因未丢失,菌体的生长与其荧光的表达同步。遗传稳定性显示其荧光表达十分稳定。在初始诱导物诱导的情况下,单菌落呈现出肉眼可见的红色,在荧光显微镜下也能观察到明显的红色荧光。α-乳糖可取代常用诱导物IPTG,且在浓度为5 g/L时,使菌体的荧光表达量达到高值。通过建立基因编辑菌株活菌浓度与荧光强度的关系曲线（R2=0.9999）,细胞浓度的检测限达到104 CFU/mL。（5）通过综合比较三种不同方式构建的重组菌株中mCherry表达的遗传稳定性,筛选出一株最适的标记菌株,将其接种到大鼠胃肠道分段样品中进行特异性荧光检测,并以实验室前期构建的GFP标记的E.coli K99作为对照研究。结果表明,每隔24 h连续转接10次的继代实验发现采用CRISPR/Cas9技术构建的标记菌株荧光表达最为稳定;在实际样品检测中,相比于GFP标记的肠毒性大肠杆菌,mCherry标记菌株的荧光强度检测的变异系数显著降低（p=0.0328）,表明荧光蛋白mCherry在大鼠胃肠段中能克服背景荧光干扰,检测更准确。综上所述,本实验以肠毒性大肠杆菌K99作为通用病原菌,构建利用红色荧光蛋白标记的攻毒菌株,此重组菌能稳定表达红色荧光蛋白,排除动物胃肠道自发荧光干扰,为病原菌的特异性标记研究及动物攻毒模型的构建提供了方法学基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 产肠毒素性大肠杆菌的研究概况
•   1.2 ETEC的毒力因子及致病机制
•     1.2.1 黏附素
•     1.2.2 肠毒素
•   1.3 ETEC的防治措施
•   1.4 荧光标记技术
•     1.4.1 荧光蛋白的结构和性质
•     1.4.2 荧光蛋白的标记方式
•     1.4.3 荧光蛋白的应用
•   1.5 攻毒模型的研究现状
•   1.6 研究意义及内容
•     1.6.1 研究意义
•     1.6.2 研究技术路线
•     1.6.3 研究内容
• 第二章 RFP表达载体的构建及ETEC表达宿主的筛选
•   2.1 前言
•   2.2 试验材料
•     2.2.1 菌株和载体
•     2.2.2 培养基、工具酶和试剂
•     2.2.3 仪器与设备
•   2.3 试验方法
•     2.3.1 基于RFP基因原核表达载体的构建
•     2.3.2 RFP质粒转化宿主ETEC及阳性克隆的筛选
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 红色荧光蛋白mKate和 mCherry的 PCR扩增结果
•     2.4.2 重组质粒菌落PCR鉴定
•     2.4.3 重组质粒双酶切鉴定
•     2.4.4 重组质粒在工程菌及ETEC中的表达
•     2.4.5 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry的 PCR验证
•     2.4.6 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry荧光显微镜观察
•     2.4.7 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry荧光强度的测定
•     2.4.8 重组菌E.coli K99-mCherry的分子鉴定
•     2.4.9 重组菌E.coli K99-mCherry和菌株E.coli K99 生长曲线比较
•     2.4.10 重组菌E.coli K99-mCherry中 mCherry基因表达稳定性测定
•     2.4.11 荧光体系下E.coli K99-mCherry活菌浓度检测标准曲线的建立
•   2.5 讨论
•   2.6 小结
• 第三章 基因剂量对RFP标记ETEC的影响
•   3.1 前言
•   3.2 试验材料
•     3.2.1 菌株和载体
•     3.2.2 培养基、工具酶和试剂
•     3.2.3 仪器与设备
•   3.3 试验方法
•     3.3.1 多拷贝红色荧光蛋白mCherry重组质粒的构建
•     3.3.2 多拷贝重组质粒的转化E.coli K99 及荧光强度的测定
•   3.4 结果与分析
•     3.4.1 双拷贝重组质粒酶切鉴定
•     3.4.2 多拷贝菌株的荧光强度测定与比较
•   3.5 讨论
•   3.6 小结
• 第四章 基于表面展示系统的ETEC-RFP特异性标记
•   4.1 前言
•   4.2 试验材料
•     4.2.1 菌株和载体
•     4.2.2 培养基、工具酶和试剂
•     4.2.3 仪器与设备
•   4.3 试验方法
•     4.3.1 大肠杆菌表面展示表达载体的构建
•     4.3.2 E.coli K99 表面展示融合蛋白Lpp’OmpA-mCherry
•   4.4 结果和分析
•     4.4.1 PCR扩增结果
•     4.4.2 重组质粒pLpp’OmpA双酶切鉴定
•     4.4.3 重组质粒pLpp’OmpA-mCherry双酶切鉴定
•     4.4.4 重组菌的双酶切鉴定
•     4.4.5 重组菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry的分子鉴定
•     4.4.6 重组菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry荧光显微镜观察
•     4.4.7 E.coli K99 表面展示mCherry的生物活性检测
•     4.4.8 E.coli K99 表面展示mCherry的表达稳定性检测
•     4.4.9 荧光体系下E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry活菌浓度检测标准曲线的建立
•   4.5 讨论
•   4.6 小结
• 第五章 基于CRISPR/Cas9 系统介导的ETEC-RFP特异性标记
•   5.1 前言
•   5.2 试验材料
•     5.2.1 菌株和载体
•     5.2.2 培养基、工具酶和试剂
•     5.2.3 仪器与设备
•   5.3 试验方法
•     5.3.1 质粒DNA的制备
•     5.3.2 大肠杆菌K12和K99 的基因组DNA的制备
•     5.3.3 大肠杆菌K99和DH5α感受态细胞的制备
•     5.3.4 基因敲入位点的选择
•     5.3.5 sgRNA的设计及基因编辑载体的构建
•     5.3.6 基因编辑菌株的筛选及基因编辑载体的去除
•     5.3.7 基因编辑菌株的荧光检测
•     5.3.8 基因编辑菌株分子背景鉴定
•     5.3.9 诱导剂对基因编辑菌株红色荧光蛋白表达的影响
•     5.3.10 基因编辑菌株生长特性曲线测定
•     5.3.11 基因编辑菌株稳定性的测定
•     5.3.12 荧光体系下基因编辑菌株活菌浓度标准曲线的建立
•   5.4 结果与分析
•     5.4.1 假基因位点的选择和验证
•     5.4.2 mCherry基因编辑菌株的构建及鉴定
•     5.4.3 基因编辑质粒的去除
•     5.4.4 基因编辑菌株荧光显微镜观察
•     5.4.5 基因编辑菌株的分子鉴定
•     5.4.6 不同诱导剂及其浓度对荧光蛋白表达量的影响
•     5.4.7 基因编辑菌株的生物活性检测
•     5.4.8 基因编辑菌株中mCherry的表达稳定性检测
•     5.4.9 荧光体系下基因编辑菌株活菌浓度检测标准曲线的建立
•   5.5 讨论
•   5.6 小结
• 第六章 ETEC-RFP标记菌株的综合评价及其在大鼠胃肠道样品中特异性荧光检测
•   6.1 前言
•   6.2 试验材料
•     6.2.1 菌株和试剂
•     6.2.2 实验动物
•     6.2.3 仪器与设备
•   6.3 试验方法
•     6.3.1 不同标记方法中mCherry基因表达稳定性的比较
•     6.3.2 胃肠道内容物样品处理方法
•     6.3.3 胃肠道内容物的荧光特异性检测
•     6.3.4 统计分析
•   6.4 结果与分析
•     6.4.1 标记菌株mCherry基因表达稳定性的比较
•     6.4.2 大鼠不同胃肠段内容物对荧光检测的干扰
•   6.5 讨论
•   6.6 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录B 基因编辑的序列
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 苏雅婷

导师: 郭小华

关键词: 肠毒性大肠杆菌,标记

来源: 中南民族大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中南民族大学

分类号: Q78

总页数: 106

文件大小: 7440K

下载量: 18