革兰氏阳性菌RNA降解关键酶的结构与功能研究

论文摘要

RNA降解体是rRNA成熟和mRNA降解过程中一个重要的酶复合体,主要由核糖核酸酶、RNA解旋酶及糖酵解酶组成。其中参与RNA降解的关键核糖核糖酸酶包括RNase E、RNase Y以及RNase J。RNase E介导了大肠杆菌等革兰氏阴性菌的RNA加工过程;RNase Y和RNase J则在革兰氏阳性菌RNA加工过程中起着至关重要的作用。研究表明RNase Y是RNase E的同功蛋白,为革兰氏阳性菌RNA降解体中的支架蛋白。RNase Y的缺失将导致革兰氏阳性菌生长速率的减慢,并同时影响细胞形态、孢子形成以及抗生素的敏感性等,与细胞中毒性基因的表达调控相关。此外,革兰氏阳性菌的RNA降解过程还依赖于RNase J核糖核酸酶,其具有核酸内切酶及5’-3’核酸外切酶活性。RNase J为酿脓链球菌生长所必需,然而其在枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌中却能够完全被敲除。关于革兰氏阳性菌中RNA降解的具体机制目前尚不清楚。本文成功地解析获得了耐辐射奇球菌RNase J（DraRNase J）与UMP及DraRNase J活性缺失点突变蛋白与6nt RNA复合体的高分辨率晶体结构并进行了相应的生化实验验证。结果表明RNase J属于β-CASP亚家族蛋白,具有保守的双金属离子（锌离子）催化反应,其活性中心的两个Zn离子介导了 OH·对RNA磷酸二酯键的亲核攻击。RNaseJ中还存有一个保守的基序,能够特异性的识别底物RNA的5’端磷酸基团,决定了其核糖核酸外切酶活性的方向性;同时,Mn离子介导了该蛋白二聚化的过程,调控了 RNase J的核酸内切酶/外切酶的活性转换。这些研究成果揭示了革兰氏阳性菌RNA成熟关键酶RNase J蛋白的催化和活性转换机制,并首次为细胞内高浓度锰离子调控RNA代谢相关酶活性提供了直接证据。此外,本文研究表明耐辐射奇球菌rnj全长基因及其C末端为细胞生长所必须,该基因的杂合突变子将导致耐辐射奇球菌生长速率减慢以及环境胁迫适应性的降低。RNase Y能够与RNase J在内的多种RNA降解体相关组分相互作用。本文在耐辐射奇球菌中敲除了编码RNase Y蛋白的my基因,并获得了纯合突变株。进一步的研究表明该突变株能够极大的敲低耐辐射奇球菌rnj基因的拷贝数,造成耐辐射奇球菌生长速率的减缓,并且显著影响其所具有的极端抗性。RNA-seq转录组测序分析结果表明rny的缺失将导致耐辐射奇球菌中代谢相关途径,离子转运相关途径以及DNA损伤响应相关蛋白转录本的富集,进一步导致耐辐射奇球菌基因组稳定性降低。此外,通过比较野生株和突变株的转录组数据,筛选出了一系列潜在的RNaseY相关操纵子,为后续的研究提供了思路。

论文目录

• 项目资助
• ACKNOWLEDGEMENTS
• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第1章 综述
•   1.1 耐辐射奇球菌概述
•     1.1.1 耐辐射奇球菌的发现与命名
•     1.1.2 耐辐射奇球菌的形态特征及极端抗性
•     1.1.3 耐辐射奇球菌的基因组组成
•     1.1.4 耐辐射奇球菌DNA损伤修复的研究进展
•     1.1.5 耐辐射奇球菌抗氧化机制的研究进展
•   1.2 细菌RNA降解概述
•     1.2.1 革兰氏阴性菌RNA降解概述
•     1.2.2 革兰氏阳性菌RNA降解过程关键酶
•     1.2.3 革兰氏阳性菌RNA降解体的研究进展
•     1.2.4 革兰氏阳性菌mRNA降解途径
•   1.3 小结
• 第2章 DraRNase J的晶体结构与体外功能分析
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 仪器和试剂
•     2.2.2 菌种及质粒
•     2.2.3 蛋白表达菌株的构建
•     2.2.4 DraRNase J蛋白的表达与纯化
•     2.2.5 DraRNase J蛋白的核酸酶活性实验
•     2.2.6 DraRNase J晶体筛选与生长
•     2.2.7 晶体X射线衍射数据的收集和分析
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 DraRNase J全长蛋白的纯化
•     2.3.2 DraRNase J及其与UMP复合体的结晶与结构解析
•     2.3.3 DraRNase J全长蛋白和各结构域的结构总览
•     2.3.4 DraRNase J的核酸酶反应条件的优化
•   2.4 本章小结
• 第3章 DraRNase J-RNA复合体晶体结构解析
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 蛋白纯化与结晶
•     3.2.2 定点突变
•     3.2.3 DraRNase J全长蛋白及其各点突变蛋白的核酸酶活性实验
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 DraRNase J催化中心点突变蛋白核酸酶活性
•     3.3.2 DraRNase J-RNA复合体结构解析
•     3.3.3 DraRNase J RNA结合通道及DraRNase J催化机制分析
•   3.4 本章小结
• 2+介导的RNase J核酸酶活性转换'>第4章 Mn²⁺介导的RNase J核酸酶活性转换
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 菌株及质粒
•     4.2.2 DraRNase J截断蛋白及点突变蛋白的表达菌株构建
•     4.2.3 蛋白表达与纯化
•     4.2.4 DraRNase J全长蛋白、截断蛋白及各点突变蛋白的核酸酶活性。
•     4.2.5 突变株的构建
•     4.2.6 表型及生存率的测定
•     4.2.7 生长曲线的测定
•   4.3 结果与讨论
• 2+及DraRNase J的C末端对蛋白二聚化及核酸酶活性的影响'>    4.3.1 Mn²⁺及DraRNase J的C末端对蛋白二聚化及核酸酶活性的影响
• 2+调控的DraRNase J endo-和exo-核酸酶活性转换机制分析'>    4.3.2 Mn²⁺调控的DraRNase J endo-和exo-核酸酶活性转换机制分析
•     4.3.3 DraRNase J表型及生长曲线
•   4.4 本章小结
• 第5章 DraRNase Y体内外功能分析
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 菌种与质粒
•     5.2.2 突变株与补偿株的构建
•     5.2.3 生长曲线、表型及生存率的测定
•     5.2.4 突变率的测定
•     5.2.5 电子显微镜分析突变株超微结构
•     5.2.6 RNA-seq及数据分析
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 DraRNase Y蛋白的生物信息学分析
•     5.3.2 突变株的构建及表型分析
•     5.3.3 突变率分析
• △rny细胞显微结构分析'>    5.3.4 dra_△rny细胞显微结构分析
•     5.3.5 RNA-seq数据分析
•     5.3.6 差异表达基因
•   5.4 本章小结
• 第6章 总结与展望
•   6.1 总结
•   6.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 博士期间发表论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 卢梅华

导师: 华跃进

关键词: 降解体,革兰氏阳性菌,核酸酶,晶体结构

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 浙江大学

基金: 国家自然科学基金(项目编号:31210103904,31370102),中国农业部转基因生物新品种培育重大项目(项目编号:2013ZX08009003-002),中国农业部公益性行业(农业)科研专题(项目编号:201103007),浙江省自然科学基金和教育委员会(项目编号:LY13C010001,Y201329892),浙江大学中央高校基本科研业务费专项基金(项目编号:2013QNA6015),浙江省创新团队计划(项目编号:2010R50033)

分类号: Q935

总页数: 118

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