大豆GmnsLTP和GmMADS基因的克隆及功能分析

论文摘要

大豆是一种重要的粮油兼农用产品,被广泛的用于社会生活的各个领域,在世界上乃至我国都是人类获取植物蛋白质的重要来源。我国对大豆的需求量越来越高,以至于我国大豆产量远远低于这个标准,所以现阶段利用基因修饰的手段来获得高产、优质的大豆品种是一个不可阻挡的趋势。每荚粒数是构成大豆产量的重要因素,它的形成与大豆营养生长到生殖生长的转化密切相关。因此,花芽期是决定大豆每荚粒数形成的重要阶段。项目组前期通过对大豆花芽“四粒荚”突变体的转录组测序,筛选到二个差异表达量高的候选基因,即GmnsLTP和GmMADS。虽然已有报道显示,植物nsLTP和MADS-box基因在植物根、叶发育,开花期控制,花器官形成和果实发育等生长过程中起着非常重要的作用,但目前还未见其在植物荚粒形成方面的相关报道。因此,本项目以大豆四粒荚突变体花芽（V6-stange）为材料,针对前期转录组测序筛选到的2个差异表达候选基因（GmnsLTP和GmMADS）克隆全长cDNA序列;并以此为基础成功构建超表达和CRISPR/Cas9基因编辑载体;利用农杆菌介导法和花粉管通道法转化大豆“吉农18”野生型,通过对转基因植株的分子检测及表型鉴定,深入挖掘差异表达基因的生物学功能。为进一步研究大豆荚粒形成相关基因的克隆及分子遗传学机理研究奠定基础。主要研究结果如下:1.利用RACE技术成功扩增出大小分别为662 bp和923 bp的差异基因全长cDNA序列。2.以pCAMBIA1302为载体骨架,成功构建超表达载体pCAMBIA1302-Gmn sLTP,pCAMBIA1302-MADS;采用杭州百格CRISPR/Cas9载体构建试剂盒（B GK041）成功构建Cas9-GmnsLTP,Cas9-GmMADS基因编辑载体。3.生物信息学分析结果显示,GmnsLTP基因为典型的植物nsLTP家族I型基因具有跨膜结构域,为分泌蛋白;GmMADS基因为典型的植物MADS-box家族Type-II型基因,无跨膜结构域。构建差异基因GmMADS的系统进化树,结果显示GmMADS属于MADS-box家族中的AP3亚族。4.亚细胞定位结果显示,差异表达基因GmnsLTP编码的蛋白位于细胞膜外,属于膜外分泌蛋白;差异基因GmMADS编码的蛋白定位在细胞核上,属于核蛋白。5.PCR和Southern blot检测结果显示,农杆菌介导法未获得转基因阳性植株;花粉管通道法获得pCAMBIA1302-GmnsLTP T2代阳性植株5株,T1代pCAMBIA1302-GmMADS阳性植株10株。6.Real-time PCR检测结果显示GmnsLTP基因在转基因大豆中的表达量显著高于对照野生型,在转基因大豆叶中的表达量最高,其次是茎,表达量最低的是根。7.表型分析结果显示,9个与产量相关的植株农艺性状,除株高外,其余测定值均高于对照吉农18野生型,且与对照存在显著差异。8.转基因大豆抗寒性生理指标测定结果显示,转基因植株的生理指标明显高于对照吉农18,可以看出GmnsLTP基因表现出较好的耐寒性。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 绪论
• 第一章 文献综述
•   1.1 大豆转录组测序技术的研究进展
•   1.2 非特异性脂质转移蛋白研究进展
•   1.3 MADS-box基因家族研究进展
•   1.4 目的与意义
•   1.5 技术路线
• 第二章 GmnsLTP和 GmMADS基因的克隆及表达载体构建
•   2.1 实验材料
•   2.2 实验方法
•   2.3 结果与分析
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• 第三章 GmnsLTP和 GmMADS基因的遗传转化
•   3.1 实验材料
•   3.2 实验方法
•   3.3 结果与分析
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨桐珲

导师: 姚丹

关键词: 大豆,基因克隆,表达分析

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 吉林农业大学

分类号: Q943.2;S565.1

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000294

总页数: 64

文件大小: 2685K

下载量: 41