光响应蛋白调控细胞黏附和迁移

论文摘要

对细胞粘附和迁移的远程、时空和可逆控制对于许多生物技术应用和细胞疗法是非常重要的实现手段。在本文中,我们展示了在修饰有插入Arg-Gly-Asp（RGD）配体的光响应蛋白LOV2的表面上实现光调控细胞的粘附和迁移。蓝光照射引起LOV2的结构变化,并暴露RGD序列,导致蛋白质粘附和迁移增强。把表面放回黑暗的环境会导致配体重新“笼住”,细胞分离。黏附和迁移可在多个循环中可逆调节。通过精确控制光的位置,可以实现细胞的定向迁移。利用光控蛋白结构控制配体的显示实现细胞黏附和迁移的可逆和时空控制,对于准确定义和调节细胞材料在体外和体内的相互作用具有很大的前景。第一章介绍了文章的背景知识,所用到的材料和实验方法。首先我们对光响应蛋白及其应用进行了简单介绍,又介绍了课题中所用到的LOV2蛋白,我们提到了它的来源及其在光调控下的性质。随后我们介绍了细胞黏附和迁移的基本情况,它的生物学意义和分子基础,我们重点提及了整合素和RGD序列在细胞黏附中的作用。第二章详细介绍了对LOV2突变蛋白的设计和实验方法,对其性质进行了初步的测试。我们在LOV2蛋白的J α螺旋上选择了两个RGD序列的插入位点,它们对LOV2蛋白的结构影响最小。另外,设计了在LOV2蛋白C端连上RGD序列作为阳性对照和把前述三种RGD换成RGE作为阴性对照。所设计的六种突变蛋白具有和原始LOV2蛋白相同的光调控性质,它们在光照和黑暗状态下的颜色变化可用肉眼直接观察到,我们又测量了它们的UV,荧光和CD光谱。在第三章中,我们设计了以酶联免疫吸附测定（ELISA）为基础的结合性ELISA实验和竞争性ELISA实验来验证LOV2蛋白的光控解折叠功能,以及解开折叠后的暴露的RGD序列是否能够被整合素蛋白相结合,以实现预想的蛋白功能。结果显示突变蛋白与整合素结合符合我们的预期,在光照下结合得很好而在黑暗下则结合很弱。第四章我们介绍了通过把细胞在修饰有LOV2突变蛋白的培养基表面上培养,可以实现光调控细胞的黏附和迁移。由于蓝光照射可致LOV2突变蛋白的Jα螺旋展开,使得其中的RGD序列暴露出来,因而能使整合素与之结合,从而细胞可以黏附上去;在黑暗状态下,突变蛋白发生结构变化,展开的部分重新折叠成Jα螺旋,RGD序列被隐藏起来,细胞也与突变蛋白分离。利用这个性质,我们用一个移动的光纤照射表面实现了调控细胞的运动,细胞会朝着光照射的位点移动。我们也观察了细胞在黏附过程中所发生的形态变化及其分离时的可恢复性。最后,我们对以上工作进行了总结,并提出进一步深入研究的展望。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 光响应蛋白简介
•     1.1.1 蛋白质功能
•     1.1.2 细胞光遗传学工具——光响应蛋白
•     1.1.3 光响应蛋白调控细胞行为
•   1.2 LOV2蛋白质
•     1.2.1 向光素
•     1.2.2 LOV2蛋白空间结构与光调控下的结构变化
•   1.3 细胞黏附和迁移
•     1.3.1 细胞黏附及其分子基础
•     1.3.2 整合素和RGD
•     1.3.3 细胞外基质
•     1.3.4 细胞迁移
• 第二章 LOV2蛋白突变体的设计和表征
•   2.1 引言
•     2.1.1 光调控细胞黏附和迁移
•     2.1.2 设计思路
•   2.2 材料和方法
•     2.2.1 质粒的构建
•     2.2.2 蛋白质的表达与纯化
•     2.2.3 蛋白质透析,浓缩与光照实验
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 对突变蛋白在不同状态下吸光光谱和荧光光谱的测定
•     2.3.2 对突变蛋白在不同状态CD谱的测定
• 第三章 ELISA实验验证突变蛋白与整合素结合的能力及其光控性质
•   3.1 引言
•   3.2 酶联免疫吸附试验
•     3.2.1 酶联免疫吸附试验简介
•     3.2.2 酶联免疫吸附试验的分类
•     3.2.3 酶联免疫吸附试验的应用
•     3.2.4 HRP,TMB,BSA简介
•   3.3 用ELISA实验验证突变蛋白与整合素结合的能力及其光控性质
•     3.3.1 设计思路
•     3.3.2 材料和方法
•     3.3.3 结果与讨论
• 第四章 利用LOV2突变蛋白实现光调控细胞的黏附和迁移
•   4.1 光调控细胞的黏附
•     4.1.1 实验设计
•     4.1.2 材料和方法
•     4.1.3 结果与讨论
•   4.2 光调控细胞的迁移
•     4.2.1 实验设计
•     4.2.2 材料和方法
•     4.2.3 结果与讨论
• 第五章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 研究生期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 曹为

导师: 曹毅

关键词: 光响应蛋白,蛋白,细胞黏附,细胞迁移,光调控,整合素,聚合酶链式反应,酶联免疫吸附实验

来源: 南京大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 南京大学

分类号: Q25

总页数: 73

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