液态活检多模板（CTC、cfDNA、WBC）二代测序技术优化

论文摘要

从癌症现状数据来看,癌症已然成了人类死亡的主要原因,而中国人群无论在癌症发生率还是死亡率都占了全世界大约50%的比例。自测序技术的迅速发展以来,肿瘤液态活检相关的检测应用越来越热门,液态活检结合测序的技术应用更是给癌症治疗带来的新的解决方案和方向。本研究基于珠海圣美生物医疗诊断技术有限公司多模板(cfDNA、CTC、WBC)二代测序技术,对整个技术流程进行了实验操作优化研究,论文先用细胞系样本进行优化验证,再用实际病例样本对优化前后的病例结果进行对比分析,证实优化后流程的改善效果。本文中的样本会用LiquidBiopsy(Cynvenio Biosystems)系统对全血细胞进行富集纯化得到CTC(CTC样本),每一份病人全血样本留取血浆样本(cfDNA样本来源),WBC样本(个体对照样本),再用ThermoFisher文库构建试剂盒及Ion torrent测序平台进行二代测序,测序数据经过公司内部生物信息分析软件Target call对三种样本进行成对分析,最后得到多模板(CTCWBCcfDNA)二代测序癌症热点突变位点。结果:(1)在细胞系验证实验过程中,cfDNA样本的提取操作优化明显提高cfDNA得率;CTC富集过程中芯片的预处理以及非提取直接裂解方法的优化研究,消除了二代测序建库过程中PCR扩增抑制物,优化后的操作可100%检出细胞系突变位点,对照优化前的操作则高至50%的机率会检不出。(2)在153例实际病例分析中,对优化前后的病例样本进行对比分析。优化前操作的69份病例cfDNA与CTC两组分均检出且有一致位点、两者均有检出无一致位点、单独cfDNA检出、单独CTC检出位点情况占比分别为21.74%、21.74%、15.94%、15.94%,合计有检出的占比为75.36%,未检出占比为24.64%;优化流程操作的84例病例的占比分别为21.43%、44.05%、17.86%,合计有检出的占比有92.86%,未检出占比为7.14%。优化流程明显增加了cfDNA与CTC的检出率;同时,优化前后的操作流程,都存在cfDNA或者CTC组分检出位点不一致的情况,优化前后流程操作的cfDNA与CTC检出有重合的位点占比约33.3%、45.2%。(3)多模板二代测序结果与PCR方法、一代测序平台进行了验证,17例病例三种方法检测一致性达到88%。(4)探索性的研究了非常规样本(胸水样本)的检测,全血中cfDNA组分未检测出突变位点,CTC中检测出突变位点,而随后胸水样本连续检测中,均检测出了一样的突变位点,检测表现了高度的一致性。结论:(1)优化流程明显提高了二代测序质量及细胞系突变位点检出情况,无论是在细胞系的验证还是病例分析中。同时优化流程增加了cfDNA与CTC两组分有重合位点的占比(优化前25.3%、优化45.2%),这表明cfDNA与CTC多模板测序的必要性,多模板二代测序检测能够一次检测得到更加完善的信息。(2)多模板二代测序结果与PCR方法和一代测序方法的验证结果(三者一致性88%)验证了多模板二代测序热点突变检测技术的可靠性,对突变检测技术应用提供了一个选择。(3)探索性的研究了非常规样本(胸水样本)的检测,胸水样本连续检测结果显示出高度的一致性,提示了其它形式的体液(如胸水、积液等)也有可能适用于这个技术平台,扩大本技术应用的可能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 癌症现状概况
•   1.2 癌症检测技术发展历史概要
•   1.3 癌症检测相关技术简介
•   1.4 循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells CTCS）检测及分析技术
•     1.4.1 循环肿瘤细胞检测意义
•     1.4.2 循环肿瘤细胞捕获技术
•     1.4.3 CTC的鉴定技术
•     1.4.4 CTC的分析应用技术
•   1.5 多模板（CTC、cf DNA、WBC）二代测序技术介绍
•     1.5.1 多模板（CTC、cfDNA、WBC）二代测序研究意义
•     1.5.2 测序多模板的获取及对接二代测序技术原理
•     1.5.3 技术过程主要示意图
•     1.5.4 多模板（CTC、cfDNA、WBC）+二代测序技术策略优势
•   1.6 本课题研究目的
• 第二章 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•   2.2 实验方法
• 第三章 研究内容及结果
•   3.1 研究内容
•     3.1.1 影响多模板技术中的实验流程优化研究-细胞系研究
•     3.1.2 流程优化前后病例样本分析-多模板二代测序实验结果对比分析
•     3.1.3 同一病例样本单点突变不同方法验证比较
•     3.1.4 探索性研究—胸水样本连续检测研究
•   3.2 结果讨论
•     3.2.1 细胞系优化研究结果讨论
•     3.2.2 病例样本结果分析讨论
•     3.2.3 未检出突变位点原因讨论
• 第四章 结论与展望
•   4.1 结论
•   4.2 展望及探索性研究
•     4.2.1 CTC捕获的进一步展望研究
•     4.2.2 不同形式液态活检二代测序的进一步扩大范围应用展望
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 钟碧娴

导师: 梁书利,唐东江

关键词: 癌症报告,癌症检测技术,循环肿瘤细胞,液态活检,二代测序

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,肿瘤学

单位: 华南理工大学

分类号: R730.43;Q78

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.002925

总页数: 83

文件大小: 4010K

下载量: 69