嗜热葡萄糖淀粉酶与α-淀粉酶克隆表达和酶学研究

论文摘要

葡萄糖淀粉酶（EC 3.2.1.3,Glucoamylases,GA）,又称糖化酶,是制糖工业中的重要用酶。它可以水解淀粉或寡糖中的α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键,最终产生葡萄糖。目前已知的葡萄糖淀粉酶分布在碳水化合物GH15家族和GH97家族,未见分布在GH57家族的葡萄糖淀粉酶。GH57家族的酶多来源自嗜热古菌和细菌,是一个嗜热酶汇聚的家族。本研究原本计划研究一个嗜热的II型普鲁兰糖酶,因此从GH57家族中进行了筛选,选择了来源于嗜热细菌Thermocrinis minervae的假定II型普鲁兰糖酶,命名为GA-Themi。GA-Themi的蛋白序列在Genebank数据库中最高相似性仅为40%,但是GA-Themi序列中含有GH57家族的特有保守氨基酸。委托生物公司合成该GA-Themi基因序列后,在E.coli中获得了可溶性的表达。对重组表达的GA-Themi蛋白进行纯化后,测定其对可溶性淀粉的比酶活为1.79 U/mg。最适pH为7.0,最适反应温度为90℃。GA-Themi的热稳定性很好,在70℃、80℃、90℃下的半衰期分别为2.5 h、2h、1.5 h。三种金属离子Mg2+、Co2+、和Ni+都能使GA-Themi的酶活提高2倍。以GA-Themi水解可溶性淀粉的酶活为100%,其对普鲁兰糖、支链淀粉和直链淀粉的酶活依次为76.5%、71.7%和64.2%。GA-Themi还能比较微弱的水解糖原和葡聚糖。这说明GA-Themi具有水解α-1,4和α-1,6糖苷键的能力。已知的II型普鲁兰糖酶对普鲁兰糖的水解能力要强于淀粉,而且对(a-1,6糖苷键的水解能力也远强于α-1,4糖苷键,因此Ⅱ型普鲁兰糖酶对普鲁兰糖的水解产物主要是三糖,会产生少量的葡萄糖和麦芽糖。但是GA-Themi水解普鲁兰糖只产生了葡萄糖,未见三糖。进一步验证GA-Themi水解淀粉的产物,发现也仅有葡萄糖,而且GA-Themi还可以直接水解麦芽糖为葡萄糖、水解麦芽三糖为葡萄糖。这些催化特点表明,GA-Themi不是II型普鲁兰糖酶,而是一个新型的葡萄糖淀粉酶。这是首次发现一个属于GH57家族的葡萄糖淀粉酶。与已知的GH15和GH97家族的葡萄糖淀粉酶相比较,GA-Themi的催化特点是对普鲁兰糖具有较高的水解能力,即具有更强水解α-1,6糖苷键的能力,同时热稳定性良好。这种特点使GA-Themi更适合应用在支链含量较高的糯米等淀粉的水解上。α-淀粉酶（EC3.2.1.1,Amylase,Amy）是一种能随机水解淀粉、普鲁兰糖等碳水化合物中的α-1,4糖苷键,产生麦芽低聚糖或麦芽糊精的水解酶。它也是制糖工业中的一种重要用酶。制糖工业中需要嗜热α-淀粉酶,但是目前商业中的高温α-淀粉酶和后续工艺中的酶的pH值不一致,实际应用中需要调节pH。为了寻找嗜热嗜酸的α-淀粉酶,本研究筛选了来源于嗜热泉古菌Acidilobus sp.7A的一个假定α-淀粉酶,命名为AmyAC。AmyAC的序列属于GH13家族,但是与GH13家族中可以形成独立的分支,与已知α-淀粉酶的蛋白序列相差较大,可能具有新的催化特性。委托生物公司合成该AmyAC基因序列后,在E.coli中获得了可溶性的表达。但是以可溶性淀粉、普鲁兰糖、糖原、支链淀粉、直链淀粉等为底物检查酶活,均未测到酶活。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 绪论
•   1 葡萄糖淀粉酶与GH15、GH97家族
•     1.1 葡萄糖淀粉酶
•     1.2 高温葡萄糖淀粉酶的应用及研究现状
•     1.3 GH15和GH97家族
•   2 Ⅱ型普鲁兰糖酶与GH57家族
•     2.1 Ⅱ型普鲁兰糖酶
•     2.2 GH57家族
•       2.2.1 GH57家族酶的种类
•       2.2.2 GH57家族的蛋白序列特征
•   3 Ⅱ型普鲁兰糖酶与葡萄糖淀粉酶的区别
•   4 α-淀粉酶
•     4.1 α-淀粉酶简介
•     4.2 高温酸性α-淀粉酶应用及研究现状
•   5 嗜热酶的筛选策略
•     5.1 筛选酶的常规方法
•     5.2 从糖苷水解酶数据库中筛选嗜热酶的方法
•   6 研究意义、目的及研究内容
•     6.1 研究意义
•     6.2 研究目的
•     6.3 研究内容
•       6.3.1 来源于T.minervae嗜热葡萄糖淀粉酶的克隆表达及酶学性质的测定
•       6.3.2 GH13家族来源于Acidilobus sp.7A的假定α-淀粉酶的筛选以及克隆表达
• 第二章 来源于T.minervae嗜热葡萄糖淀粉酶的克隆表达及酶学性质的研究
•   1 实验材料
•     1.1 蛋白序列来源
•     1.2 菌株及载体
•     1.3 生物信息学分析软件与网址
•     1.4 实验仪器
•     1.5 实验试剂
•     1.6 培养基及试剂的配方
•   2 实验方法
•     2.1 生物信息学分析
•       2.1.1 蛋白序列的获取
•       2.1.2 GA-Themi与GH57家族5种酶的保守位点分析
•       2.1.3 GA-Themi与GH57家族蛋白序列系统进化树的构建
•       2.1.4 GA-Themi的信号肽分析
•       2.1.5 ga-themi目的基因的获取
•     2.2 葡萄糖淀粉酶（GA-themi）重组表达菌株的构建
•       2.2.1 琼脂糖凝胶电泳
•       2.2.2 ga-themi目的基因片段的获取
•       2.2.3 pET28a质粒片段的获取
•       2.2.4 目的片段（ga-themi）与pET28a载体连接
•       2.2.5 重组表达质粒的转化
•     2.3 葡萄糖淀粉酶（GA-Themi）蛋白的表达与纯化
•       2.3.1 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）及所用试剂的配制
•       2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
•       2.3.3 镍柱纯化所用试剂的配制
•       2.3.4 Brodford法测定蛋白浓度
•       2.3.5 镍柱亲和层析纯化蛋白
•     2.4 酶学特性与水解产物的检测
•       2.4.1 DNS法测酶活
•       2.4.2 DNS的配制
•       2.4.3 酶学性质的测定
•       2.4.4 薄层层析（TLC）的原理
•       2.4.5 薄层层析（TLC）的方法
•   3 实验结果
•     3.1 基因序列的获取与分析
•       3.1.1 信号肽分析
•       3.1.2 获得GA-Themi的基因
•     3.2 GA-Themi蛋白的克隆表达
•       3.2.1 目的基因（ga-themi）与pET28a载体质粒的获得
•       3.2.2 重组子的筛选与鉴定
•     3.3 蛋白的表达与纯化
•     3.4 GA-Themi蛋白的酶学特性
•       3.4.1 比酶活的测定
•       3.4.2 最适pH
•       3.4.3 最适温度
•       3.4.4 热稳定性
•       3.4.5 金属离子耐受性
•     3.5 GA-Themi蛋白的底物特异性
•     3.6 GA-Themi蛋白的水解产物分析
•       3.6.1 淀粉水解产物
•       3.6.2 普鲁兰糖水解产物
•       3.6.3 麦芽糖水解产物
•       3.6.4 麦芽三糖水解产物
•     3.7 葡萄糖淀粉酶GA-Themi在CAZy中的分布
•       3.7.1 葡萄糖淀粉酶（GA-Themi） BLAST相似性分析
•       3.7.2 GA-Themi分别与GH 57、GH15、GH97家族蛋白保守序列分析
•       3.7.3 GA-Themi蛋白与GH57家族进化树的分析
•   4 讨论
• 第三章 从GH13家族中筛选来源于Acidilobus sp.7A的α-淀粉酶蛋白序列并克隆表达
•   1 实验材料
•     1.1 蛋白序列来源
•     1.2 菌株与质粒
•     1.3 生物信息学分析
•     1.4 实验仪器
•     1.5 实验试剂
•     1.6 培养基及实验试剂
•   2 实验方法
•     2.1 生物信息学分析
•       2.1.1 蛋白序列的筛选
•       2.1.2 AmyAC与GH13家族蛋白序列保守位点的分析
•       2.1.3 AmyAC与GH13家族蛋白序列系统进化树的构建
•       2.1.4 AmyAC蛋白的信号肽分析
•       2.1.5 amyac基因的获取
•     2.2 构建AmyAC的重组表达菌株
•     2.3 蛋白的表达与纯化
•   3 实验结果
•     3.1 生物信息学分析
•       3.1.1 AmyAC与GH13家族蛋白序列保守位点的分析
•       3.1.2 AmyAC与GH13家族蛋白序列系统进化树的构建
•       3.1.3 AmyAC蛋白的信号肽分析
•       3.1.4 amyac基因的合成
•     3.2 AmyAC蛋白的克隆
•       3.2.1 amyac基因片段与p-ClodⅢ质粒的获取
•       3.2.2 amyac基因和p-ColdⅢ重组的质粒双酶切验证
•     3.3 蛋白的表达与纯化
•       3.3.1 蛋白纯化实验结果
•     3.4 酶活的测定
•   4 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究生期间发表论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李风玲

导师: 彭惠

关键词: 高温葡萄糖淀粉酶,高温酸性淀粉酶,型普鲁兰糖酶,家族

来源: 安徽大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 安徽大学

分类号: Q55;Q78

总页数: 73

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