游燕杜春华李东娴王鹏邓兰兰张晓南
（云南省药物研究所云南昆明650111)
【摘要】目的：建立阿奇霉素胶囊微生物限度检查法并进行方法学验证。方法：按《中国药典》2015年版四部制剂通则1105、1106项下要求进行试验。结果：需氧菌总数检查采用薄膜过滤法（1：100供试液，冲洗量为700ml），霉菌和酵母菌检查采用培养基稀释法（1:20供试液，1ml/皿），大肠埃希菌采用薄膜过滤法（1：10供试液，分8膜，冲洗量为700ml）。结论：该方法不影响污染微生物的生长，适用于阿奇霉素胶囊的微生物限度检查。
【关键词】阿奇霉素胶囊；微生物限度；培养基稀释法；薄膜过滤法；中和剂；方法学验证
【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）21-0339-02
阿奇霉素为半合成的十五元环大环内酯类抗生素[1]。其作用机理是通过与敏感微生物的50s核糖体的亚单位结合，从而干扰其蛋白质的合成。抗菌谱广，对流感杆菌、淋球菌、化脓性链球菌等细菌具有显著的抗菌效果[2]，因此对多种常见细菌感染病具有良好的抗菌作用[3]。临床上主要用于敏感微生物所致的呼吸道、皮肤和软组织感染。由于其抗菌疗效显著，近年来在国内得到了广泛应用，为使临床用药更加安全有效，实施微生物限度检查是确保药品卫生质量的有效途径[4]。本文通过参考《中国药典》2015年版四部方法建立阿奇霉素胶囊微生物限度检查方法并进行验证，证明采用的方法适用于相应检测要求。
1.仪器与材料
1.1仪器
隔水式电热恒温培养箱（型号：GSP-9160MBE，上海博迅实业有限公司），生化培养箱（型号：LRH-150，上海一恒科学仪器有限公司），匀浆仪（型号：JT-C，漯河海德实验设备有限公司），二级生物安全柜（型号：BSC-1100ⅡB2-X，济南鑫贝西生物技术有限公司）
1.2材料
HTY-反复使用全封闭薄膜过滤器、微孔滤膜（尼龙，尺寸：Φ50mm，孔径：0.45μm），一次性泵管。
1.3试药阿奇霉素胶囊
1.4培养基
胰酪大豆胨液体培养基，批号170310；胰酪大豆胨琼脂培养基，批号1706282；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号170608；沙氏葡萄糖液体培养基，批号3106032；
麦康凯琼脂培养基，批号160303；麦康凯琼液体培养基，批号161228；pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，批号1708102。（沙氏葡萄糖液体培养基来源于广东环凯微生物科技有限公司，其余培养基均来源于北京三药科技开发公司。）
1.5试验菌株
铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、黑曲霉［CMCC(F)98003］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］，上述5种菌种都来源于中国食品药品检定研究院。
2.方法
按《中国药典》2015年版四部通则1105、1106微生物限度检查法规定，本品微生物限度标准为：每1g供试品中，需氧菌总数不得过103cfu，霉菌和酵母菌总数不得过102cfu，大肠埃希菌不得检出。
2.1菌液制备
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的的制备参照新版药典通则1105。制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
2.2供试液制备
取供试品10g，加入含10%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，45℃水浴至胶囊壳溶解，即得1:10的供试液。取1:10的供试液1ml加至9ml含10%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀，即为1:100的供试液。
3.方法适用性试验
3.1需氧菌总数计数方法适用性试验
试验组:取1:100供试液1ml，加入含0.5%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液150ml中，混匀，用薄膜过滤法处理，每膜用水浴至45℃的含0.5%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗700ml（每次100ml，共冲洗7次，7次冲洗中前4次使用30rpm转速，后3次使用50rpm转速），在第7次冲洗液中加入1ml菌落数不大于100cfu的阳性菌液，抽滤至干后取出滤膜，过滤面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行做两个膜，倒置30～35℃培养3～5天。
供试品对照组：同试验组操作，最后一次不加阳性菌。
菌液对照组：取含0.5%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液150ml，用薄膜过滤法处理，每次100ml（每膜冲洗700ml），在最后一次的冲洗液中加入阳性菌液，其余按试验组操作，测定菌液对照组的菌落数。
中和剂对照组：取0.5%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml加入含0.5%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液150ml，用薄膜过滤法处理，每次100ml(每膜冲洗700ml，7次冲洗中前4次使用30rpm转速，后3次使用50rpm转速)，在最后一次的冲洗液中加入阳性菌液，其余按试验组操作。
阴性对照组：取含0.5%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液700ml，用薄膜过滤法处理，每次100ml（每膜冲洗700ml），取膜过滤面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板，平行制备两个膜，倒置于培养箱在30～35℃培养3～5天。
计数方法适用性试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内；中和剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5～2范围内。
3.2霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验
试验组：取1:20供试液9.9ml于灭菌试管中，加入制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1ml，使其终浓度为每1ml含菌落数不大于100cfu的菌液，从试管中吸取1ml注入灭菌平皿中，立刻倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，待其凝固后，倒置于恒温培养箱中20～25℃培养72h。每个菌种平行制备2个平皿，测定试验组的菌落数。
供试品对照组：取1:20供试液9.9ml于灭菌试管中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液0.1ml，其余按试验组操作，测定供试品对照组的菌落数。
菌液对照组：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9ml于灭菌试管中，加入制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1ml，使其终浓度为每1ml不大于100cfu的菌液，其余按试验组操作，测定菌液对照组的菌落数。
中和剂对照组：取含10%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9ml于灭菌试管中，加入制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1ml，使其终浓度为每1ml不大于100cfu的菌液，其余按试验组操作，测定菌液对照组的菌落数。
阴性对照组：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml至平皿中，平行制备2个平皿，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基
3.3控制菌检查方法的验证
试验组：取1:10的供试液1.25ml，加入含0.5%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液200ml中，混匀，用薄膜过滤法处理，每膜用水浴至45℃的含0.5%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗700ml（每次100ml，共冲洗7次，7次冲洗中前4次使用30rpm转速，后3次使用50rpm转速），在第7次冲洗液中加入1ml菌落数不大于100cfu的阳性菌液，抽滤至干后取出滤膜，放入200mlTSB中，30～35℃培养18～24小时。其余操作和结果判断按2015版药典通则1106进行。阴性对照组：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1.25mL按大肠埃希菌检查法操作。试验组应检出大肠埃希菌，阴性对照组不得检出。试验结果表明，大肠埃希菌检查可采用薄膜过滤法（分8膜）。
4.结果
需氧菌总数检查采用1:100供试液进行薄膜过滤法，700ml冲洗液冲洗；霉菌和酵母菌检查采用培养基稀释法（1:20供试液，1ml/皿）；大肠埃希菌采用薄膜过滤法检查（分8膜）。采用以上方法均能消除阿奇霉素胶囊的抑菌性且需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数进行验证试验，药典规定的5种阳性菌的回收比值都符合要求。
5.讨论
通过参考多篇关于阿奇霉素微生物限度检查方法的文献[5、6]，均采用了低速离心和薄膜过滤相结合的方法来消除其抑菌作用。由于《中国药典》2015年版在抑菌活性的去除或灭活方法方面删除了离心沉淀法，本次研究摒弃了离心沉淀法，根据新版药典建立阿奇霉素胶囊微生物限度检查法，采用中和剂和薄膜过滤法相结合的方法，操作更科学合理，缓冲液用量相对减少，且能保证消除供试品的抑菌作用。
《中国药典》2015年版提出，若试验中使用了中和剂，那么应设立中和剂对照组，以此来确认所使用的中和剂不影响污染微生物的生长[7]。本研究中采用了0.5%吐温80溶液作为中和剂，笔者在做试验设计时，做了中和剂组和中和剂对照组，且二者的菌落数比值在0.5～2之间，说明0.5%吐温80溶液不影响污染微生物的生长。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015.
[2]刘素霞.阿奇霉素的药理及其临床应用观察[J].甘肃科技，2014，30（21）:129-130.
[3]胡掌珠，吴谨，张建，等.阿奇霉素治疗感染性疾病的临床疗效评价[J].中国医院用药评价与分析，2016，2（16）:276-278.
[4]达朝荣，陈建强.药品微生物限度检验误差影响因素分析[J].北方药学，2016，13（1）:177-178.
[5]张俭俭，田志国.阿奇霉素胶囊微生物限度检查方法研究[J].《医药前沿》，2011，01（19）:45-46.
[6]徐巍巍，肖利红，姚福鑫.二代大环内酯类抗生素微生物限度检查法研究[J]煤炭与化工，2015，38（8）:1961-1963.
[7]国家药典委员会.中国药典分析检测技术指南[S].中国国医药科技出版社，2015:568.