论文摘要
目的:胚胎发育到受精后27小时左右的双细胞中期,其生命活动依然主要依赖于在卵母细胞中合成的各种蛋白质和RNA,因此卵母细胞的发育对受精卵的首次卵裂至关重要。哺乳动物卵母细胞在发育成熟过程中经历复杂的两次减数分裂过程。卵母细胞在第一次减数分裂前期的双线期受阻,此时的细胞核膨大,也称生发泡（germinal vesicle,GV）。在垂体性激素的刺激下,卵母细胞恢复减数分裂,表现为生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD）。从GV到GVBD的过程与有丝分裂过程中的G2/M过渡高度相似,是卵母细胞成熟过程中的第一个重要事件,也是保证减数分裂完成和胚胎正常发育的关键过程。虽然已经有研究证实Akt参与小鼠卵母细胞成熟过程,但其上下游的分子机制仍需要进一步探索。蛋白激酶B（Protein kinase B,PKB/Akt）作为一种Ser/Thr激酶,参与细胞多种生命活动。Akt活化的关键步骤是它的PH结构域与3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3）结合,并被介导转位至细胞膜发生磷酸化激活,而PIP3是PI3K信号途径受到生长因子等的刺激活化后催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇的产物。在过去的25年中,Akt信号领域有了深入的研究和发现,许多发现证实Akt与和人类健康和疾病有着重要的关系。我们之前的报道表明,Akt可能通过磷酸化的Cdc25B促进小鼠受精卵的细胞分裂,而Cdc25B是Cdc2的重要上游催化因子之一,Cdc2是组成成熟促进因子（Maturation promoting factor,MPF）的分子之一,在G2/M过渡过程中发挥重要作用。蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）也是Ser/Thr激酶,在许多细胞功能中对Akt有重要的调节作用,同时已有许多研究证明了PKC参与哺乳动物受精和受精卵发育的多种调控过程,但在小鼠卵母细胞发育过程中的作用及与Akt的关系还有待阐明。最近的报道显示钙调蛋白（Calmodulin,CaM）和PIP3可以一起结合Akt的PH结构域,协同促进钙信号传导。钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ）是受Ca2+/钙调蛋白调控的一种Ser/Thr激酶。研究发现CaMKⅡ是钙和钙调蛋白在多种细胞中的G2/M转化过程中的作用靶点,但其在卵母细胞从GV到GVBD的减数分裂过程中作用机制尚不清楚。本研究使用qPCR,Western blotting和免疫荧光方法证明了pAkt1（Ser473）在卵母细胞双线期阻滞释放过程的表达和定位变化;随后使用pAkt1（Ser473）特异性抑制剂SH-6,PKC抑制剂Sotrastaurin和CaMKⅡ抑制剂KN-93分别处理细胞,通过Western blotting和免疫荧光方法检测pAkt1（Ser473）,pPKCδ（Thr505）,pCaMKⅡ（Thr286）,Cdc25B和pCdc2（Tyr15）的表达和定位,初步探究了pAkt1（Ser473）,pPKCδ（Thr505）和pCaMKⅡ（Thr286）在小鼠卵母细胞第一次减数分裂恢复过程中的作用和关系。研究方法:1、在本研究中,首先收集GV、GVBD、MⅡ期卵母细胞,应用qPCR检测Akt三种亚型在不同时期卵母细胞中的表达,Western blotting检测pAkt1（Ser473）和Cdc25B的蛋白表达变化;随后用pAkt1（Ser473）特异性抑制剂SH-6处理卵母细胞后,Western blotting和免疫细胞荧光染色法检测pAkt1（Ser473）和Cdc25B、pCdc2（Tyr15）的表达和定位变化,明确pAkt1（Ser473）在细胞从GV期到GVBD期的作用。2、使用PKC抑制剂Sotrastaurin处理细胞,比较处理组与对照组卵母细胞进入GVBD的百分比,同时检测pAkt1（Ser473）,pPKCδ（Thr505）,Cdc25B和pCdc2（Tyr15）表达和定位变化,明确pPKCδ（Thr505）对小鼠卵母细胞发育和pAkt1（Ser473）的作用。3、CaMKⅡ抑制剂KN-93分别处理细胞,统计卵母细胞进入GVBD的百分比,检测pAkt1（Ser473）表达和定位变化,同时使用SH-6培养细胞检测pCaMKⅡ（Thr286）的表达变化,明确pAkt1（Ser473）和pCaMKⅡ（Thr286）对小鼠卵母细胞发育及彼此间的相互作用。结果:1、qPCR结果显示GVBD期Akt1的mRNA水平高于GV和MⅡ期,与Western blotting检测结果相同;SH-6处理细胞后,GVBD百分比、pAkt1（Ser473）和Cdc25B水平下降,pCdc2（Tyr15）上升;免疫荧光显示处理组pAkt1（Ser473）、Cdc25B和pCdc2（Tyr15）定位改变。2、Sotrastaurin处理细胞后,GVBD百分比、pAkt1（Ser473）和Cdc25B水平下降,pCdc2（Tyr15）上升,而SH-6处理细胞pPKCδ（Thr505）水平无明显改变。3、KN-93处理组GVBD百分比、pAkt1（Ser473）水平下降,同时SH-6处理组pCaMKⅡ（Thr286）水平也下降;免疫荧光结果显示处理组蛋白定位较对照组有改变。结论:下调pAkt1（Ser473）抑制了Cdc25B表达,而且降低了pCdc2（Tyr15）的去磷酸化水平,同时也抑制了小鼠卵母细胞的双线期阻滞的释放;当pPKCδ（Thr505）受抑制时,磷酸化的Akt1（Ser473）显著下降,暗示pPKCδ（Thr505）可能是一个Akt1上游激酶;抑制pAkt1（Ser473）时pCaMKⅡ（Thr286）下降,同时抑制pCaMKⅡ（Thr286）时pAkt1（Ser473）及卵母细胞的双线期释放也受抑制,表明pAkt1（Ser473）和pCaMKⅡ（Thr286）在此过程中可能存在相互作用关系。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 刘玲玲
导师: 邓欣
关键词: 小鼠卵母细胞,生发泡破裂,蛋白磷酸酶,钙调蛋白依赖性蛋白激酶
来源: 中国医科大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 中国医科大学
基金: 国家自然科学基金(No.81370712)
分类号: Q23
DOI: 10.27652/d.cnki.gzyku.2019.001461
总页数: 53
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标签：小鼠卵母细胞论文; 生发泡破裂论文; 蛋白磷酸酶论文; 钙调蛋白依赖性蛋白激酶论文;