陈蓉[作者简介：陈蓉（1982-），女，四川南充人，硕士研究生，主要从事微生物学和免疫学方向研究；Email：chenr1232@163.com
通讯作者：朱红，Email：zhuhongyuxia@163.com]，王晓晗2，王云聪2，袁裕敏2，何榕2，廖文欣2，杨漆2，张微2，朱红1
（1川北医学院，四川南充637000；2川北医学院微生物学与免疫学教研室，四川南充637000）
摘要：目的：了解铁观音冲泡后不同时间段菌落的生长情况，为人们健康的饮茶方式提供理论依据。方法：模拟生活中大多数人泡茶和饮茶的习惯，选取市面上某知名品牌的安溪铁观音，用烧开的饮用水进行冲泡，将不同时间段的茶水接种于固体培养基上进行培养，观察并计菌落数。同时接种相同时间段的白开水为对照。结果：不经醒茶的茶水中有肠道致病菌生长，第一泡茶汤中的菌落数超标，经醒茶后的第二、三泡茶汤和隔夜茶中菌落数均符合国家标准。结论：1.单纯的醒茶茶水茶叶对微生物有一定的抑制作用；2.醒茶可能会过滤某些肠道致病菌。
关键词：铁观音；醒茶；隔夜茶；菌落数
中国的茶文化博大精深，茶叶对人体的保健功效深入人心，大多数人都有喝茶的习惯，选择上好的茶叶固然重要，但健康的饮茶方式同样不可小觑。现在大家流行的观点是泡茶之前需醒茶，并且隔夜茶不能喝。有报道称好茶慢饮，才能发挥出茶叶中微量金属元素的营养价值，而长时间浸泡的茶，由于茶汤中的蛋白质、糖类等会成为细菌、霉菌繁殖的养料，其营养功效不仅不会增加，反而不能饮用[1]。目前，对茶叶水对口腔、肠道致病菌的抑菌作用研究得较多[2,3]，生活中茶叶冲泡后的茶叶水中细菌的生长情况，是否有肠道致病菌生长，至今未见报道。本实验模拟日常生活中人们的泡茶冲泡方式，取不同时间段的茶叶水分别接种于3种不同的固体培养基上，放入生化培养箱中培养24h，取出培养皿观察并计数。参照国家标准《GB19296-2003茶饮料卫生标准》[4]，为健康、正确的饮茶方法、时间提供参考。
1、材料与方法
1.1材料：
1.1.1仪器：高压蒸汽灭菌锅（AUTOCLAVEGI80TW）、电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司DGG-9123AD型）、三用水箱（金坛市富华仪器有限公司600型）、超净工作台（AIRTECH苏净安泰）、分析天平（METTLERTOLEDOME204E）、生化培养箱（TAISITESPX-250BⅢ）、冰箱（MideaBCD-550WKM）、移液器（GILSONP10010-100uL）及移液器吸嘴、容积300mL的毛玻璃杯（带塑料盖子）、普通电热水器、锥形瓶、培养皿、酒精灯、量筒、涂布器等。
1.1.2药品：实验所选取的某知名品牌安溪铁观音为真空包装，避免了运输过程中的杂菌污染。（约9.5g）、饮用水、75％酒精、SS琼脂（杭州天和微生物试剂有限公司HTWSB116250g）、沙保罗氏琼脂（杭州天和微生物试剂有限公司HTWSB157250g）、YEASTEXTRACT(OXOIDLP0021500g)、TRYPTONE(OXOIDLP0042500g)、AgarPowder(SolarbioCat#A8190500g)、SodiumChloride(SolarbioCat#SB210100g)等。
1.2方法：
1.2.1培养基的制备：LB固体培养基、沙保罗氏固体培养基和SS固体培养基按照《GB4789.28-2013食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》的说明配制【4】。
1.2.2茶叶水的制备：为了模拟日常生活中冲泡方法，本实验取5个相同的带杯盖毛玻璃杯，编号后用刚烧开的饮用水烫洗备用，取编号为1的玻璃杯中放入1个包装袋约9.5g的铁观音茶叶，加入300mL刚烧开的饮用水，盖上杯盖，浸泡3min后倾倒出茶汤于编号为2的玻璃杯中，盖上杯盖，即为第一泡茶汤（编号2）；再加入300mL刚烧开的饮用水于原毛玻璃杯中，盖上杯盖，浸泡3min后倾倒出茶汤于编号为3的玻璃杯中，盖上杯盖，即为第二泡茶汤（编号3）；再加入300mL刚烧开的饮用水于1号毛玻璃杯中，盖上杯盖，即为第三泡茶叶水（编号1）；再在编号为4的玻璃杯中放入一个包装袋约9.5g的铁观音茶叶，加入300mL刚烧开的饮用水，盖上杯盖，浸泡3min后倾倒出茶汤，再加入300mL刚烧开的饮用水，盖上杯盖，即为第二泡茶叶水（编号4）；最后在编号为5的玻璃杯中加入300mL刚烧开的饮用水，盖上杯盖，即为白开水（编号5）。
1.2.3接种的时间：冲泡后第一天：10:00、15:00、20:00；冲泡后第二天：10:00、15:00、20:00。首次的接种时间为茶汤制备完成的60min过后，此时的水温适合饮用。第一泡茶汤（编号2）仅为前四个时间段接种。
1.2.4接种的方法：取LB、沙保罗氏、SS固体培养基若干放入超净工作台中，用紫外线消毒，消毒完成后，开始接种。为了避免空气中的病原微生物污染茶叶水，本实验中毛玻璃杯杯盖在茶汤的制备和接种时为敞开状态，其余时间为密闭状态。操作前戴上一次性医用丁晴手套，用75%酒精喷洒手套消毒，毛玻璃杯放入超净工作台前用75%酒精喷洒消毒。用移液器移取100uL的毛玻璃杯中的样液到固体于培养基上，将涂布器置于酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却30s后进行涂布，使样液铺满整个培养基。同一时间段的每个编号的样本接种在3种固体培养基上为一个组，同一组接种3次并作好标记，将接种过后的培养皿放入37℃的生化培养箱中培养，24h后取出，观察菌落生长情况并计数。
2结果与分析
将各时间段的3种固体培养基为一个组的3次接种菌落数求出平均值。第一泡茶汤（编号2）的平均菌落数（101CFU/mL）见表1，参照国家标准《GB19296-2003茶饮料卫生标准》[5]由表1可知，菌落数远超所规定茶饮料中菌落总数应小于或等于100CFU/mL的标准。沙保罗氏固体培养基和SS固体培养基上的菌落生长情况（同一组的3个培养皿随机选取1个拍照），知SS固体培养基上出现了明显的红色菌落，可能为肠道致病菌，故若饮用第一泡茶汤可能会导致饮用者肠道感染，不建议饮用。第二泡茶汤（编号3）、第二泡茶叶水（编号4）和第三泡茶叶水（编号1）在不同时间段、不同培养基上的菌落情况均为未发现菌落，参照以上标准可知，经过醒茶的茶汤或茶叶水在微生物指标上是达标的，而且隔夜茶也是达标的。白开水（编号5）的菌落数（101CFU/mL）见表2，白开水（编号5）的LB固体培养基、沙保罗氏固体培养基和SS固体培养基的菌落生长情况（同一组的3个培养皿随机选取1个拍照），由表2、国家标准《GB5749-2006生活饮用水卫生标准》[6]可知本次实验所选取的饮用水烧开后的白开水在前两个时间段的菌落数达到所规定生活饮用中菌落总数应小于或等于100CFU/mL的标准，需特别注意的是，白开水在24h后，也就是“隔夜”之后菌落总数增长了10倍，已经严重超标了。通过白开水和几种茶水的菌落生长情况对比可知，茶水中含有抑菌物质，抑制了白开水中微生物的生长繁殖。
3讨论
本研究显示，日常生活中冲泡铁观音时，未醒茶的茶水经不同培养基培养后，在SS培养基中有红色菌落生长，红色菌落疑为肠道致病菌，后续将对红色菌落进行细菌的定性鉴定。饮用者饮用未经醒茶的茶水可能易发生肠道感染，故醒茶十分必要。醒茶后的茶水与白开水经不同培养基培养后，白开水的菌落数量明显多于茶水，可能与茶叶水具有一定的抑菌作用有关，该结果与王韵阳[2]等的研究结果一致。醒茶后的茶水与白开水经不同培养基培养后，在SS培养基中未见红色菌落生长，提示在这些菌落中可能无肠道致病菌，饮用后不易发生肠道感染。
经醒茶后的第二、三泡及隔夜茶茶水经培养后，菌落数符合茶饮料卫生标准、食品安全国家标准及生活饮用水卫生标准等标准。从病原微生物角度分析，隔夜茶亦可饮用。但是茶叶经长时间冲泡、过夜后，其微量元素、理化性质等是否发生改变，是否不利于人体，有待进一步研究。
参考文献：
[1]唐敏,侯渝嘉,黄尚俊,等.茶汤微量金属元素的溶出动态研究[J].西南农业学报,2012,25(5):1874-1878.
[2]王韵阳.张超英.闫志勇.茶叶水浸液对部分肠道致病菌的抑菌作用[J].青岛大学医学院学报,2011,47(6):537-538.
[3]鲁晓晴,张超英,王斌.茶叶水浸液对肠道致病菌抑菌作用的研究[J].中华医院感染学杂志,2009,19(5)532-533.
[4]GB19296-2003茶饮料卫生标准.
[5]GB4789.28-2013食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求.
[6]GB5749-2006生活饮用水卫生标准.