Activin A对小鼠早期胚胎干细胞系建立及分化的影响

论文摘要

小鼠多能性胚胎干细胞（mouse pluripotent embryonic stem cells,mESCs）和上胚层胚胎干细胞（epiblast stem cells,EpiSCs）分别是从囊胚内细胞团（inner cell mass,ICM）和上胚层（epiblast）分离获得。ESCs其多能性的维持依靠Mek1/2、GSK3通路抑制剂（2i）及白血病抑制因子（LIF）;而EpiSCs是由激活素A（Activin A,Act A）、成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）支持。本实验室利用添加Act A和bFGF化学成分明确的培养基（不包括KSR和饲养层细胞）培养小鼠囊胚获得了一种新型胚胎干细胞系（AFSCs）。本研究首先探究单独的Act A和bFGF对小鼠早期胚胎建系及对AFSCs细胞系诱导的影响,其次,用骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein4,BMP4）,GSK3通路抑制剂（CHIR99021）和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）分别替代AF培养基中的bFGF,形成AB,AC,AL三种培养基,培养AFSCs,使其诱导为一种具有早期特殊胚层特征并具有自我更新能力和多能性的细胞。1.类上胚层干细胞系的建立将小鼠受精后3.5天的囊胚（E3.5）分别放入AF（Act A+bFGF）、A（Act A）、2A（2×Act A）、4A（4×Act A）和2F（2×bFGF）五种培养液中培养,在AF、2A、4A中成功获得了AF/SCs（与AFSCs的建立来源及方法相同）、2A/SCs和4A/SCs三种类上胚层干细胞系,且建系效率分别为15%、14.3%和7.2%。4A/SCs形态上类似AF/SCs,2A/SCs呈现杂合状态,二者AP染色均有阳性细胞。与2A/SCs相比,4A/SCs中多能基因和分化基因都显著提高。2.Act A对AF/SCs细胞系的影响将建立的AF/SCs细胞系放在添加不同浓度的Act A和bFGF的6种培养液（Act A、2×Act A、4×Act A、bFGF、2×bFGF、4×bFGF）中培养,获得了6种细胞系,分别为AF-A/SCs、AF-2A/SCs、AF-4A/SCs、AF-F/SCs、AF-2F/SCs和AF-4F/SCs。AP染色结果显示添加Act A组的阳性细胞数要比添加bFGF组的细胞数多。另外AF-4A/SCs高表达Nanog、Gata4和Cdx2;但AF-4A/SCs嵌合结果显示在胚胎和胚外结构中没有标记细胞,不具备贡献到胎儿的能力。3.Act A和BMP4共同作用对AF/SCs细胞系的影响由BMP4、CHIR99021和LIF分别替代AF/SCs培养基中的bFGF,对AF/SCs进行诱导,诱导后的细胞系分别命名为AF-AB/SCs、AF-AC/SCs和AF-AL/SCs。AF-AB/SCs和AF-AL/SCs与AF/SCs克隆形态相似,AP都呈阳性。AF-AB/SCs和AF-AL/SCs中高表达Nanog、Gata6和T。通过嵌合体制备技术证明:当把AF-AB/SCs和AF-AL/SCs注射到8细胞胚胎,在体外培养44小时,发现两种细胞既贡献到ICM又贡献到滋养外胚层（trophectoderm,TE）。进一步进行体内移植实验结果证明AF-AB/SCs只贡献到E6.5的胚外组织,而AF-AL/SCs既不贡献到胚胎也不贡献到胚外组织。转录组分析结果显示:AF/SCs、AF-AB/SCs和AF-AL/SCs有不同的基因表达模式,AF-AB/SCs中发育调节基因上调,部分差异表达基因富集于胚胎外组织发育和多能性信号通路。综上所述,Act A具有单独支持和维持干细胞自我更新的能力。Act A和BMP4可以将AF/SCs转化为类中胚层干细胞。由于人的ESCs的培养条件也是依赖Act A和bFGF,这个研究为人的ESCs培养及分化提供了新的见解。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
•   1.1 小鼠胚胎干细胞研究进展
•     1.1.1 早期胚胎发育与胚层分化
•     1.1.2 小鼠多能干细胞研究进展
•     1.1.3 与小鼠胚胎干细胞多能性维持相关的信号通路
•   1.2 小鼠上胚层干细胞的研究进展
•     1.2.1 小鼠上胚层干细胞研究背景
•     1.2.2 小鼠上胚层干细胞研究相关信号通路
• 第二章 类上胚层干细胞的建立
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 实验设备及耗材
•     2.1.3 实验试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 培养液的配制
•     2.2.2 小鼠类上胚层干细胞的建立
•     2.2.3 小鼠类上胚层干细胞的初步鉴定
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 小鼠类上胚层干细胞系的建立
•     2.3.2 形态鉴定和碱性磷酸酶染色结果
•     2.3.3 染色体、生长特性的分析
•     2.3.4 免疫荧光染色和qRT-PCR分析
•   2.4 讨论
• 第三章 Act A对AF/SCs的影响
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验动物
•     3.1.2 实验耗材及设备
•     3.1.3 实验试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 培养液的配制
•     3.2.2 AF/SCs细胞系的诱导
•     3.2.3 诱导后细胞系的初步鉴定
•     3.2.4 在AF-4A/SCs中脂质体转染td Tomato质粒
•     3.2.5 嵌合体小鼠的制备及检测
•     3.2.6 E6.5小鼠胚胎的分离
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 形态特征和碱性磷酸酶染色结果
•     3.3.2 多能基因和分化基因表达结果
•     3.3.3 小鼠AF-4A/SCs体内发育潜能检测
•   3.4 讨论
• 第四章 Act A和BMP4共同作用对AF/SCs细胞的影响
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验动物
•     4.1.2 实验耗材及设备
•     4.1.3 实验试剂
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 培养液的配制
•     4.2.2 AF/SCs向AF-AB/SCs、AF-AC/SCs及 AF-AL/SCs细胞系的诱导
•     4.2.3 诱导后细胞系的初步鉴定
•     4.2.4 嵌合体小鼠的制备（详细实验过程见3.2.5）
•     4.2.5 体外胚胎培养及固定染色
•     4.2.6 E6.5胚胎的分离（详细实验过程见3.2.6）
•     4.2.7 转录组分析
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 形态特征和碱性磷酸酶染色结果
•     4.3.2 诱导细胞系的多能性鉴定
•     4.3.3 诱导细胞系发育潜能检测
•     4.3.4 AF-AB/SCs和AF-AL/SCs的分子特征
•   4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郑丽

导师: 包斯琴

关键词: 囊胚,胚胎干细胞,上胚层胚胎干细胞

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古大学

分类号: Q954.4

总页数: 82

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