一、mRNADD-PCR技术及其在植物抗病基因研究中的应用（论文文献综述）
何永林[1]（2021）在《假茄科雷尔氏菌对瓜类作物的致病性以及南瓜响应病菌侵染的转录组和代谢组分析》文中研究表明青枯菌复合种（Ralstonia solanacearum species complex,RSSC）具有丰富的寄主多样性,其中假茄科雷尔氏菌（R.pseudosolanacearum）分布范围最广,引起的植物青枯病往往造成巨大的经济损失。近年来,葫芦科作物青枯病在我国少数区域有逐步发生严重的趋势,但关于不同寄主来源青枯菌菌株对葫芦科植物及其他科植物的致病性情况不清楚,葫芦科植物抵抗不同致病性菌株侵染的机理尚不明确,难以制定有效的防治葫芦科作物青枯病的措施。为此,本研究在前期研究工作已明确南瓜、丝瓜和苦瓜等葫芦科作物均可发生青枯病的基础上,以22株不同寄主来源的假茄科雷尔氏菌菌株为研究材料,测定其对南瓜、丝瓜和苦瓜的致病性,并鉴定其生理小种类型,从中筛选出对南瓜具有致病性差异的菌株,对接种后南瓜植株防御相关的生理生化性状以及转录组和代谢组进行分析,以期揭示南瓜对不同致病性菌株侵染的抗性机理。主要研究结果如下:1、测定不同寄主来源的22株菌株对南瓜、丝瓜和苦瓜的致病性结果发现,源自葫芦科的菌株（Cq01、Bg07、Tg03）以及四季豆的菌株（Kb01）对这三种瓜具有强致病力,源自烟草、花生和辣椒上的5株菌株具有弱致病力,但大部分源自非葫芦科的菌株对三种瓜无致病性。以青枯菌模式菌株GMI1000（生理小种1号）灌根接种8种植物为参照,测定16株代表菌株的生理小种,发现这些菌株均为生理小种1号。采用伤根灌菌和注射菌液的方法将5株菌株不同浓度的菌液接种到南瓜植株上,筛选出对南瓜具有强致病力的菌株Cq01和无致病性菌株GMI1000;两者接种南瓜1 d后,南瓜根系内部均检测到病菌;南瓜接种Cq01菌株5 d的植株发病率为30.56%,接种7 d后的植株发病率高达77.78%,而接种GMI1000菌株的南瓜植株一直未发病。2、Cq01和GMI1000菌株均能诱发南瓜产生活性氧和过敏性坏死反应,前者诱导程度更为强烈;Cq01菌株在侵染早期到发病中期均能显着提高南瓜植株的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和多酚氧化酶（PPO）的酶活性,并能促进丙二醛（MAD）产生;GMI1000菌株也能显着增强南瓜植株的POD活性,但显着低于Cq01处理;GMI1000菌株只能在侵染早期增强南瓜植株的PAL、SOD和PPO的活性,不能促进MAD的产生。结果表明,南瓜接种病原菌后,植株体内的PAL、POD、SOD和PPO酶活性以及MAD含量与接种病菌的毒力强弱有关。3、南瓜响应Cq01和GMI1000菌株侵染的转录组分析结果发现,Cq01菌株接种的南瓜植株有146个差异基因,上调110个。差异基因的GO注释主要富集在乙烯激活信号通路、茉莉酸介导的信号通路、细菌防御反应、水杨酸响应和果胶分解代谢过程等方面;KEGG注释主要富集在与植物细胞壁降解相关的果胶裂解酶,与信号转导相关的钙结合蛋白和乙烯反应转录因子,与抗病相关的RPM1互作蛋白4、MYB转录因子和EREBP转录因子以及与氨基酸合成相关的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶。GMI100菌株接种的南瓜植株有53个差异基因,上调49个。差异基因的GO注释主要富集在硝酸盐同化、寡肽运输、硝酸盐转运和植物型细胞壁组织等方面;KEGG注释主要富集在病程蛋白相关蛋白,与苯丙烷生物合成相关的肉桂醇脱氢酶和β-葡萄糖苷酶,与抗氧化相关的谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽,与能量代谢相关的果糖-1,6-二磷酸酶,与氮素代谢相关的硝酸盐/亚硝酸盐转运体等。分别选取Cq01和GMI1000与寄主互作途径的8个基因进行q RT-PCR验证,结果与转录组测序结果基本一致。4、南瓜响应Cq01和GMI1000菌株侵染的代谢组分析结果发现,接种Cq01菌株的南瓜植株有3个上调差异代谢物（鸟氨酸、苏糖酸和D-赤酮酸内酯）;接种GMI1000菌株的南瓜植株有3个差异代谢物,上调1个（葡萄糖酸）,下调2个（1,3-丙二胺和棉子糖）。南瓜响应Cq01和GMI1000菌株侵染的转录组和代谢组关联分析结果发现,南瓜响应Cq01菌株侵染的最密切的代谢途径是精氨酸生物合成途径,南瓜响应GMI1000菌株侵染最密切的代谢途径是戊糖磷酸途径。综上所述,源自葫芦科的菌株和少数非葫芦科的菌株对瓜类作物具有致病性,而大部分源自非葫芦科的菌株则表现无致病性;Cq01菌株侵染南瓜植株诱导防御相关的生理生化反应比GMI1000菌株侵染南瓜诱导的反应更为强烈;据南瓜响应Cq01和GMI1000菌株侵染的转录组和代谢组关联分析结果推测,南瓜受到Cq01菌株侵染后,植株体内经过精氨酸生物合成途径产生对植株自身有毒性作用的鸟氨酸代谢物,降低植株对青枯病的抗性,从而导致植株发病。GMI1000菌株可诱导南瓜植株体内增强戊糖磷酸途径产生抗病物质,抑制病菌在植株体内扩展,使植株免受病菌为害。
蒲小剑[2]（2021）在《红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化》文中研究表明红三叶（Trifolium pratense L.）是营养价值和草产量仅次于苜蓿（Medicago Sativa L.）的多年生豆科牧草之一。该牧草用途广泛,具有广阔的开发应用前景。白粉菌（Erysiphales）作为一类普遍而重要的专性生物营养型病原菌,可严重降低红三叶草产量与品质,限制其在草牧业中的应用与发展。为阐明白粉菌对红三叶生理生化、内源激素和细胞结构的影响并验证抗白粉病TpGDSL基因的功能,本研究首先对感白粉病品种（岷山红三叶）和×抗白粉病品种（“甘农RPM1”红三叶）的杂交F2代进行抗病性评价,并建立白粉病抗性分离群体,采用人工接菌的方法,测定白粉菌侵染后不同抗性群体的生理生化变化、内源激素含量和细胞结构变化;利用F2代群体的抗病单株和感病单株作为试验材料,进行转录组分析;克隆由转录组分析得到的红三叶抗白粉病相关候选基因TpGDSL,同时构建p HB-GDSL过表达载体,并遗传转化拟南芥。取得的主要结果如下:1.白粉病病原菌为三叶草白粉菌（Erysiphe trifoliorum）;人工接菌后抗病材料的电导率（EC）先升高后降低、感病材料持续升高,接菌15 d时感病材料EC较接菌前增加3.57倍。抗病材料的相对含水量（RWC）先降后升,感病材料持续降低,接菌15d时感病材料的RWC含量较接菌前减少了31.85%。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性与过氧化氢酶（CAT）活性和可溶性糖（WSC）含量分别在接菌后第7 d和11 d升高,随后降低,其最高值分别为534.43±10.07 U·g-1·min-1 FW、411.73±4.08 U·g-1·min-1 FW、136.53±1.00 U·g-1·min-1 FW和32.02±0.57 mg·g-1。接菌第15 d的丙二醛（MDA）与游离脯氨酸（Pro）含量分别是接菌前的4.84和5.38倍。接白粉菌后第1和7 d,抗病材料的玉米素（ZR）、茉莉酸（JA）与水杨酸（SA）含量出现两个峰值,感病材料接菌第1d后增加,之后持续降低。抗病材料的ABA含量先升后降,感病材料的变化趋势相反。抗病材料的ZR、JA、SA与ABA含量的分别在接菌第7 d、1 d、7 d和1 d时最大,其值分别为12.23±1.27 ng·g-1、15.55±0.30 ng·g-1、124.82±1.68 ng·g-1、483.50±125.50 ng·g-1,分别较接菌前增加3.52、0.93、1.60和1.04倍。接菌后红三叶抗病材料内源激素变化幅度大于感病材料,表明抗病材料中白粉菌对红三叶体内内源激素的效应更明显。2.抗病红三叶单株叶片的上表皮细胞宽,叶片厚度、栅栏组织厚度及蜡质含量均极显着高于感病材料（P<0.01）,分别高16.13%、22.29%、29.99%与85.90%;抗病材料的上表皮细胞宽度增大、栅栏组织加厚、栅栏组织细胞排列更紧密有序,感病材料的海绵组织厚度显着增加、海绵细胞排列松散混乱。白粉菌侵染增加了细胞壁的半纤维素、纤维素和木质素含量,降低了可溶性果胶的含量,其中抗病材料纤维素、半纤维素、木质素和羟脯氨酸糖蛋白含量略高于感病材料。3.白粉菌侵染后抗性差异红三叶代谢中DEGs分别富集在苯丙烷途径、甲醛戊酸途径、木质素和木酚素途径与硫代葡萄糖苷等代谢途径。CHRs、C2H2、HAD、MYB、b ZIP和MADS等转录因子家族基因参与红三叶白粉病防御反应。SA与IAA通路中相关基因AXR1、CYP、CAND1和PPR-like可能在红三叶白粉病防御反应中具有积极作用。细胞色素P450、氧化酶类、磷酸酶、腈水解酶及GDSL脂肪酶等家族中DEGs分别富集23、20、18、14与2条。木质素代谢途径中PAL、C4H、4CL和BGL、ABA调控路径中NAD（P）-binding Rossmann-fold、赤霉素代谢途径中2-氧戊二酸/铁（II）依赖双加氧酶及JA合成前体12-Oxo-PDA等基因均参与调控红三叶的防御过程。转录组分析显示红三叶GDSL同源基因有较高的本底表达和差异表达倍数,Log2（FC）为10.62,本研究选择GDSL基因进行研究。4.克隆得到编码366个氨基酸,全长1101bp的TpGDSL基因。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）GDSL基因与该基因氨基酸序列相似性高达86.47%。TpGDSL基因编码蛋白分子式为C1776H2704N470O561S15,相对分子量为40.9672kD,理论等电点（p I）为4.39,正、负电荷残基为20和35,不稳定系数为31.38,为不稳定蛋白,脂肪系数为81.01。TpGDSL编码蛋白可能存在于细胞外基质（Extracell）。TpGDSL蛋白主要包括36.34%α螺旋（Alpha helix,Hh）、4.10%β转角（Beta turn,Tt）、17.49%延伸链（Extended strand,Ee）、及42.08%无规则卷曲（Random coil,Cc）。该基因翻译的蛋白均由二级结构和三维结构覆盖,覆盖率和可信度分别达82%和100%。本试验采用农杆菌介导的花序浸染法将重组过表达载体p HB-GDSL转入模式植物野生型拟南芥中,得到16 lines T1代阳性转基因种子,为TpGDSL基因的功能分析奠定了基础。
滕倩[3]（2021）在《尖孢镰刀菌SIX效应基因进化关系及其在侵染紫花苜蓿过程中的作用》文中指出紫花苜蓿（Medicago sativa）是我国和世界种植面积最广最优质的豆科牧草。尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是紫花苜蓿生产上的主要病原真菌之一,严重影响草产量和品质,导致草地衰败和利用年限缩短。尖孢镰刀菌特有木质部分泌蛋白参与其对植物的侵染,但目前不同专化型SIX（Secreted-In-Xylem,SIX）基因进化关系及其在侵染紫花苜蓿过程中的作用依然未知。本论文首先研究了不同植物尖孢镰刀菌专化型SIX同源基因的进化关系,然后研究了该菌在侵染紫花苜蓿过程中的生物量,并研究了尖孢镰刀菌侵染紫花苜蓿不同时间点植株根部SIX基因相对表达量,旨在为尖孢镰刀菌的有效防治提供理论依据。主要的研究结果如下:1、尖孢镰刀菌不同专化型SIX基因进化关系。通过对尖孢镰刀菌不同专化型SIX1-SIX14基因序列的进化关系分析,发现不同专化型的SIX基因遗传进化与菌株的亲缘关系相关。SIX1-SIX14基因能够作为候选的特异性基因对不同寄主尖孢镰刀菌专化型进行检测鉴定。2、尖孢镰刀菌侵染紫花苜蓿过程中的生物量。温室致病性实验表明,尖孢镰刀菌对不同紫花苜蓿品种的生长指标都存在不同程度的影响,生长指标相对降低量存在显着差异。植株根部组织中,侵染后期比侵染前期的病菌生物量少,最后趋于稳定;尖孢镰刀菌生物侵染量变化与生长指标相对降低量呈正相关关系。3、尖孢镰刀菌侵染紫花苜蓿过程中SIX基因表达量。通过对尖孢镰刀菌T9侵染紫花苜蓿后不同时间点SIX基因变化的研究发现:尖孢镰刀菌T9在侵染苜蓿的过程中,SIX1和SIX13基因与尖孢镰刀菌对不同苜蓿品种致病力相关。
吕士凯[4]（2021）在《真菌胁迫响应TaNAC基因和小麦杂种衰亡分子机理研究》文中研究表明小麦（Triticum aestivum L.）是世界上最主要的粮食作物之一,条锈病和白粉病均是严重威胁小麦生产安全的病害。小麦杂种衰亡是一种并不少见的过早衰老或过早死亡表型,是优良基因转移及品种改良的障碍。杂种衰亡可能是由植物响应病原菌胁迫相关基因进化出多效性的叠加导致的。NAC转录因子基因家族在植物衰老和生物胁迫响应中均发挥重要的调节作用。开展小麦抗病研究,挖掘抗病TaNAC基因并探究其抗病机制,对保证小麦生产安全具有重要意义,且有助于丰富对小麦抗病机制的理解。开展小麦杂种衰亡的遗传规律分析验证、调控基因的精细定位及调控机制的多组学研究,有助于克隆杂种衰亡调控基因并解析其分子基础和调控机理,有助于消除杂种衰亡基因对育种选择造成的障碍,促进小麦育种事业的发展。同时开展小麦真菌胁迫响应、杂种衰亡及相关NAC转录因子调控的研究,明确三者的关系,有助于丰富对植物抗病基因功能与机制的理解,促进小麦聚合抗病基因杂交育种进程。本研究以兼抗白粉病与条锈病的普通小麦优异种质N9134为材料,在两种病菌胁迫下对TaNAC基因进行系统性克隆。按照从N9134得到和从小麦参考基因组提取两类,对TaNAC转录本进行比对分析,同时分析克隆得到TaNAC转录本的特征,研究它们结构变异与真菌胁迫的关系,进一步探究TaNAC基因可变剪切在小麦真菌胁迫响应中的调控规律。基于多种不同遗传群体,开展小麦杂种衰亡研究,分析并完善Ne基因的复等位基因、剂量效应等理论。创制杂种衰亡回交分离群体并结合开发的SNP标记,构建了冬小麦Ne1和Ne2的高密度遗传图谱。基于杂交测验和分子标记检测,系统分析Ne1和Ne2在我国小麦品种（系）中的分布情况。此外,基于背景一致的性状分离遗传群体（两种表型4种基因型）,借助转录组（2+3）、蛋白组和代谢组测序技术,开展小麦杂种衰亡调控机制的研究。主要研究结果如下:1、小麦TaNAC基因家族被重新鉴定为包括460个基因位点的559个转录本（IWGSC Ref Seq v1.1）;发现N9134中约1/3（54/154）的TaNAC基因在苗期参与白粉菌和条锈菌胁迫的响应过程。从两种真菌胁迫的N9134中,获得186个TaNAC转录本（167个为克隆得到）,其中180个为新转录本并上传到Gen Bank。发现真菌胁迫的N9134中,差异表达TaNAC基因转录的“非正常”编码转录本的比例更高（p=0.0098）,TaNAC MTFs编码序列的比例相对参考基因中的比例更高（p=0.003）;发现紧随NAM结构域、且相对保守的氨基酸基序（WV[L/V]CR）可能与TaNAC转录因子响应真菌胁迫有关。结果表明,小麦TaNAC基因可以通过形成不同结构变异转录本的方式响应真菌胁迫。发现并整理的响应条锈病和（或）白粉病胁迫的TaNAC及其结构变异转录本,为解析TaNAC参与小麦对生物胁迫的响应机制提供了丰富资源。2、选取由13个基因可变剪切形成的35个TaNAC转录本进行深入分析,发现可变剪切事件通过改变转录本的序列结构,进而改变其编码产物的结构、理化性质等,最终影响其亚细胞定位和转录调控活性等。通过分析TaNAC基因及其编码区的靶标taemi RNAs,发现具有可变剪切转录本的TaNAC基因与tae-mi RNA的结合位点均位于非可变剪切区域。综合上述结果推断,TaNAC基因可以通过可变剪切的转录后调控方式参与小麦响应真菌胁迫的过程;靶定位点在TaNAC基因编码区的tae-mi RNA可以独立于可变剪切行使转录后调控功能。3、构建了冬小麦Ne1和Ne2的高密度遗传图谱,其中,Ne1位于5BL上的标记NWU5B4137（383.40 Mb）和NWU5B5114（388.01 Mb）之间（IWGSC Ref Seq v1.0）,两标记相距0.50 c M;Ne2与2BS上的标记Lseq102（156.59 Mb）和TC67744（157.76Mb）共分离。系统遗传分析发现,N9134的Ne1不同于Spica和Ta4152-60的Ne1,周麦22的Ne2不同于Manitou、WL711和Pan555的Ne2;Ne基因的剂量效应也存在于中度和重度杂种衰亡系统,遗传背景也可能影响杂种衰亡的症状。通过系统分析国内外1364种小麦品种（系）中Ne1和Ne2的基因型频率,明确了二者在我国小麦主产区中呈现离散分布的特征及比例;发现我国现代小麦品种（系）Ne基因型频率的现状应该由地方品种（系）（贡献Ne1）和现代引进品种（系）（贡献Ne2）共同作用形成。根据本研究的材料及其系谱分析推断,冬小麦的Ne1可以直接来源于野生二粒小麦,而Ne2可能起源于黑麦。本研究为图位克隆Ne1和Ne2打下了坚实基础,向更好地理解小麦杂种衰亡迈出了重要一步。4、利用衰亡表型且基因型为Ne1Ne2的样本与正常表型基因型分别为Ne1ne2ne2、ne1ne1Ne2、ne1ne1ne2ne2的样本,通过转录组（2+3）、蛋白质组和代谢组联合分析,发现杂种衰亡过程主要涉及植物与病原体的互作（ko04626）、植物激素信号转导（ko04075）、内质网中的蛋白质加工（ko04141）、氨基酸的生物合成（ko01230）、苯丙烷类化合物的生物合成（ko00940）、α-亚麻酸代谢（ko00592）等KEGG途径。推断:植株防御系统失调引起在没有病菌侵染时防御反应仍被激活,产生最初的代谢产物（氨基酸）;而Ne1和Ne2协同表达,导致前述产物代谢途径失调,使其持续积累;达到一定浓度后,其作为反应底物或信号物质,激活茉莉酸（Jasmonic acid,JA）信号介导的衰老和病程相关程序性细胞死亡,继续产生并积累各种氨基酸,循环往复持续进行,导致Ne1Ne2基因型植株从一定发育阶段开始,表现细胞死亡加速的杂种衰亡性状;NAC转录因子参与这一过程的调控,且茉莉酸起关键信号转导作用。由防御系统失调引起的病程相关程序性细胞死亡,既是杂种衰亡性状的启动因素,也是杂种衰亡表型的主要形式。
祝开[5]（2020）在《宿根矮化病菌侵染甘蔗的生理与分子机制研究》文中认为甘蔗（Saccharum spp.L.）是广泛种植于热带及亚热带地区的多年生禾本科植物,是世界第一大糖料作物。由革兰氏阳性细菌Leifsonia xyli subsp.xyli（Lxx）引起的甘蔗宿根矮化病（Ratoon stunting disease,RSD）在甘蔗产区普遍发生,严重影响甘蔗生长进而造成产量和经济损失。前人的研究多集中在RSD的发生与检测、病原菌Lxx的分离培养及RSD胁迫下甘蔗的超微结构观察,且目前有关甘蔗与RSD互作的分子机制研究多是对Lxx侵染下甘蔗差异表达基因的克隆与不同胁迫处理下的定量表达研究。由于Lxx难于实现体外分离培养和对其进行遗传操作,故而也限制了Lxx与甘蔗互作机理的研究。本研究通过对甘蔗接种诱导,观察和测定了Lxx侵染对甘蔗生长和生理生化代谢的影响;以高感RSD甘蔗品种Badila为材料,利用RNA-Seq与DIA技术分析了在响应RSD病原菌胁迫过程中,甘蔗叶片与茎的m RNA及蛋白表达水平的变化;利用i TRAQ技术,分析了甘蔗感染RSD后的磷酸化蛋白质表达变化;利用转基因技术对病原菌Lxx18460基因（anti-sigma K factor,Rsk A）的功能进行了初步探究。主要的研究内容与结果如下:1.以果蔗拔地拉（Badila）和桂糖11号（GT11）健康种茎为实验材料,通过接种Lxx纯培养菌液作为RSD染病处理。利用病原菌Lxx的特异性基因Lxx18460,基于实时荧光定量PCR和Western Blot技术分析了该基因在甘蔗感染RSD后50 d、180 d、210 d的表达情况。结果表明,接种Lxx后,随着甘蔗的生长,Lxx18460在转录水平和蛋白水平表达逐渐升高。在此期间,Lxx侵染下的甘蔗较对照植株的株高、茎径、单茎重、水势以及半胱氨酸和甲硫氨酸含量均下降,而膜透性和游离氨基酸、钙调素含量增加;同时,抗性基因PAL、ZFP和NBS-LRR在转录水平的相对表达量也在Lxx侵染后上调表达。2.用Lxx菌液接种Badila和GT11健康种茎,通过对两个甘蔗品种四个时期的细胞壁组分进行测定,结果显示,在Lxx侵染下,Badila染病植株叶片的纤维素、半纤维素和果胶含量分别较对照植株下降14.88%、13.74%和11.17%,胼胝质和木质素含量分别较对照植株上升13.13%和15.29%;在GT11中,染病叶片的纤维素、半纤维素和果胶含量分别较对照植株下降7.43%、5.43%和16.7%,胼胝质和木质素含量分别较对照植株上升17.45%和15.07%。受Lxx侵染后,Badila在其工艺成熟期时地上部分干物质积累总量、全氮积累总量、全磷积累总量、全钾积累总量较对照植株分别显着下降53.5%、12.8%、11.7%、7.4%,而GT11分别下降21.8%、33.8%、6.5%、5.7%,两个品种间具有显着性差异。3.以高感RSD甘蔗品种Badila为材料,对接种Lxx后90 d的叶片与蔗茎基部样品用Illumina RNA-Seq进行测序。结果表明,RSD染病叶片较对照叶片相比共有11,802个差异表达基因,其中7,721个上调表达基因,4,081个下调表达基因;染病蔗茎与对照蔗茎相比共有9,325个差异表达基因,其中4,426个上调表达,5,059个下调表达。这些差异表达基因在甘蔗叶片和茎中所起的生物学功能和参与的代谢途径不同,综合来看,主要在光合作用、植物与病原菌相互作用中的信号通路、植物激素与次生代谢及细胞壁相关途径响应RSD胁迫。4.在转录组学的基础上,利用DIA技术对同样处理的甘蔗品种Badila的实验材料进行蛋白质组学分析。结果表明:12个甘蔗样品中共鉴定到的蛋白数量为9,702个,RSD染病叶片与对照叶片的差异表达蛋白有98个,其中上调表达蛋白40个,下调表达蛋白58个;蔗茎中筛选到的差异表达蛋白有407个,其中上、下调表达蛋白分别为179个和228个,说明甘蔗茎较叶片在蛋白水平更为积极和敏感地响应Lxx的侵染。综合叶片与蔗茎中的差异表达蛋白分析结果,这些蛋白显着富集于植物激素信号转导、苯丙素和谷胱甘肽生物合成、植物与病原菌互作途径等,这些代谢通路直接或间接参与甘蔗对RSD的响应。甘蔗叶片蛋白质组与转录组的差异表达的关联性为0.1545,而蔗茎中的差异表达关联性为0.3076。甘蔗叶片和茎中分别有11个和38个差异表达蛋白与转录组中的差异表达基因相关联,其中有7个和27个差异表达蛋白分别与各自的差异基因表达趋势相同,且大部分的关联差异蛋白与植物激素信号转导、植物与病原菌互作和植物次生代谢物合成等相关。5.利用i TRAQ技术对甘蔗感染RSD后的Badila蔗茎基部进行了磷酸化蛋白组研究。结果表明:6个甘蔗样品中共鉴定到3,924个磷酸化肽段,有3,326个磷酸化位点定位在1,879个磷酸化蛋白上。甘蔗茎在Lxx侵染90 d后与对照植株有114个差异磷酸化肽段,其中有63个表达上调,51个表达下调。对差异磷酸化蛋白的Pathway进行富集分析,结果显示,富集到差异磷酸化蛋白数目较多的通路是代谢途径、次生代谢物合成和植物病原菌互作,其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢和精氨酸生物合成为显着富集通路。6.利用转基因烟草对甘蔗宿根矮化病菌膜蛋白基因Lxx18460（anti-sigma K factor）进行了研究,转化Lxx18460后的烟草植株较野生型相比,植株生长高度降低,叶面积变小,生物量下降。净光合速率降低、内源激素合成受到抑制。Lxx18460基因主要在烟草茎中高度表达,在植株生长过程中,该基因在转录和翻译水平的表达随着时间的推移而稳定增加,其表达减缓了烟草植株的生长。Lxx18460基因表达量越高,对烟草的影响越明显。构建了受Ubi启动子控制的单子叶植物表达载体p UBTC-Lxx18460,通过农杆菌介导转化法进行甘蔗的遗传转化,将目的载体导入甘蔗品种ROC22中。经过组织培养和后期筛选,经PCR检测和Western Blot检测确证获得了转Lxx18460基因甘蔗,蛋白质检测结果也说明该基因已经在转化植株中正确表达为相应的蛋白。总之,本研究通过分析Lxx侵染甘蔗导致的生理及病理变化,探讨了甘蔗对RSD响应的生理和分子机制,并且对Lxx18460基因功能进行了初步的探讨,这些工作使我们能够更深入地了解甘蔗对RSD的应答机制,为研究RSD与甘蔗互作提供参考。
田再民[6]（2020）在《马铃薯小G蛋白基因StRab5b的克隆及其调控晚疫病抗性的功能研究》文中提出RAB蛋白在植物、动物、微生物中广泛分布,其一般通过鸟苷酸交换因子（GEFs）和GTP酶激活蛋白（GAPs）来调控信号通路的开闭。已有的研究结果表明,植物中的RAB GTPase参与植物的生长发育过程以及植物应对生物和非生物胁迫的能力,特别是在调控植物抗性建立方面的功能尤为重要。本研究从马铃薯中克隆得到小G蛋白基因StRab5b,对其编码蛋白的生物学信息,表达谱以及诱导表达进行了分析;并通过超表达和基因沉默,对StRAB 5b蛋白在调控马铃薯对晚疫病抗性以及耐盐性方面的功能进行了初步的研究,得到如下的结果:1.利用特异引物分别克隆得到StRab5b（607bp）和StRab（673 bp）基因,并对StRAB 5b蛋白结构进行预测分析,结果表明StRAB 5b蛋白的一级结构中包含的氨基酸数为200个,分子量为21.5 kDa;二级结构中有GGT2-Rab的催化位点,REP和3个棕榈酰化作用位点,16个磷酸化位点,未见信号肽,进化树的分析表明,马铃薯和烟草RAB 5b同源性高达94%,且StRAB 5b具有RAB蛋白共有的结构域RabF2（83～87）、RabF4（YYRGA,102～106）和 RabF5（131～135）;三级结构包含5个α螺旋和5个β折叠。2.表达谱分析的结果表明,马铃薯不同组织中StRab5b基因表达量由高到低依次是嫩叶、茎、老叶和根,且均存在显着差异。StRab5b基因在马铃薯不同品种中的相对表达量由高到低依次是紫花白（ZHB）、夏坡蒂（XPD）、陇薯7号（L7）、底西瑞（DXR）、中薯4号（ZS4）、大西洋（DXY）。冀张薯8号和底西瑞接种晚疫菌后StRab5b诱导表达的结果表明,该基因均呈现出先升高后降低的趋势,且在接种72 h后达最高值。3.马铃薯和烟草中瞬时表达结果表明,叶片中瞬时表达StRab5b和StRab基因后接种晚疫菌,接种部位的病斑面积均显着低于瞬时表达空载体（EV）和接种H2O的叶片;且在烟草中瞬时表达StRab5b基因后叶片病斑的面积要低于瞬时表达StRab基因,而在马铃薯中瞬时表达则呈现出与烟草中相反的结果。4.构建了StRab5b和StRab基因超表达和沉默载体,并通过遗传转化获得9株StRab5b和5株StRab的阳性转基因株系。StRab5b-L8、StRab-L5转基因株系的叶片接病后病斑面积均显着小于对照。同时,DAB染色结果表明,转基因株系接种晚疫菌后叶片中H2O2的积累量高于对照植株;台盼蓝染色的结果表明,接种晚疫菌后对照叶片上坏死细胞数量明显高于转基因植株。5.ET、JA和SA信号通路的关键酶基因ACS、LOX、NPR1的转录水平检测的结果表明,接种晚疫菌后（0～96 h）,LOX和NPR1基因的相对表达量分别在StRab5b-L8和StRab-L5中显着高于对照;而在StRab5b-L8和StRab-L5转基因株系中SOD、POD、CAT、APX的活性均高于对照（SOD活性72 h和POD活性24 h除外）。6.建立了马铃薯高效的基因沉默体系,并利用该体系对马铃薯中StPds,StRab5b和StRab同源基因进行沉默,沉默的效率分别为100%、61%和59%。接种晚疫菌后,沉默StRab5b和StRab基因的叶片上病斑面积均显着大于对照叶片上的病斑。考马斯亮蓝染色结果表明,沉默StRab5b和StRab基因的烟草叶片上菌丝体的数量要多于对照叶片。7.StRab5b-L8和StRab-L5的转基因株系耐盐性的研究结果表明,StRab5b和StRab基因能够正向调控马铃薯的耐盐性。
张卫娜[7]（2020）在《马铃薯响应逆境信号的类受体激酶基因的筛选及功能验证》文中进行了进一步梳理类受体激酶（Receptor like Kinase,RLK）是一类定位在细胞膜上的跨膜蛋白,因分子结构和功能与动物的受体蛋白激酶相类似而得名。RLK作为植物生长发育和环境适应的中央处理器,在几乎所有的生命活动中起着重要的调控作用。但马铃薯中RLK亚家族成员如富含半胱氨酸的类受体激酶（cysteinerich receptorlike kinase,CRK）和植物凝集素类受体激酶（lectin receptor-like kinase,Lec RLK）的鉴定和分析以及马铃薯中逆境相关的RLKs的筛选未见报道。本研究以马铃薯‘荷兰15号’、‘陇薯7号’以及‘大西洋’等品种为实验材料,通过对马铃薯叶片和块茎分别进行晚疫病菌（Phytophthora infestans,Pi）和干腐病菌（Fusarium sulphureum,Fs）等病原菌侵染和光照持续处理,采用生物信息学、转录组测序（RNA-Seq）、实时荧光定量PCR（q RT-PCR）以及农杆菌渗入等技术对马铃薯中RLKs尤其是逆境相关的RLKs进行鉴定分析和验证,得到如下主要结果:1.利用生物信息学方法,通过对马铃薯全基因组和已发表文章中转录组数据的提取,分析鉴定马铃薯中RLKs。结果显示,马铃薯基因组中共有479个RLKs,可分为47个亚家族。其中,PERK-1、WAK LRK10L-1、Cr RLK1L-1、LRR-XI-1和LRR-XII-1亚家族成员存在大量的部分重复现象,且PERK-1和WAK LRK10L-1亚家族可能为茄科植物特有;Cr RLK1L-1、LRR-XI-1和LRRXII-1亚家族在马铃薯中存在独特的部分重复特征。LRR-XII-1、SD-2b和WAK LRK10L-1亚家族成员存在大量的串联重复现象,其中SD-2b和WAK LRK10L-1在马铃薯中存在独特的串联重复特征。通过对已发表文章中转录组数据分析发现,L-LEC、LRK10L-2、SD-2b、WAK和WAK LRK10L-1亚家族中参与马铃薯响应生物胁迫的基因数目较多且占比例较大,部分基因在马铃薯斑纹片病菌（Candidatus Liberibacter solanacearum,Cls）和晚疫病菌（Pi）侵染时都发生差异表达,说明其可能在抵抗病原菌的过程中起重要的调控作用,可作为后续功能分析的候选亚家族和候选基因。2、利用在线软件和数据资源对马铃薯CRK亚家族的理化性质、亚细胞定位、染色体位置、基因结构和启动子区顺式作用元件等信息进行分析预测,并通过q RT-PCR技术对CRK响应水杨酸（salicylic acid,SA）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）以及病原菌侵染的表达模式进行验证。结果显示,马铃薯中存在8个CRKs,其启动子区存在多种响应激素和逆境胁迫调控的元件,其中CRK4（PGSC0003DMG400018101）和CRK8（PGSC0003DMG400015171）基因的表达随病原菌侵染时间的延长而逐渐增强,推断这两个基因在马铃薯响应病原真菌的过程中起重要的作用,可作为后续功能验证的候选基因。3、马铃薯基因组中共鉴定到113个Lec RLKs,其中G-Lec RLKs、L-Lec RLKs和C-Lec RLKs的数目分别为85、26和2。通过多序列比对,将Lec RLK亚家族成员构建进化树,并对染色体位置、基因重复现象和响应病原菌侵染的表达模式进行分析。结果显示,马铃薯Lec RLKs可分为7个分支,随机分布在12条染色体上,且47个成员参与串联重复,9个成员参与部分重复,说明串联重复是导致此家族扩增的主要因素。此外,多个Lec RLKs在响应植物病原真菌和细菌侵染时显示差异表达,PGSC0003DMG400031861和PGSC0003DMG400044943随干腐病菌（Fs）和晚疫病菌（Pi）侵染时间的延长而表达上调,可作为功能分析和进一步抗病育种的候选基因。4、马铃薯块茎经持续光照和黑暗遮光处理,提取表皮进行RNA-Seq分析。结果显示,与对照组相比,在4个不同时间点的样品中分别检测到1 288,1 592,1 737和1 870个差异表达基因,其中,普遍上调的差异基因共393个,包括4个生物碱（SGA）合成相关的基因（HMG1:PGSC0003DMG400013663;SGT1:PGSC0003DMG400011749;SGT2:PGSC0003DMG400017508;SGT3:PGSC0003DMG400011740）。Mapman功能富集表明,差异基因主要参与了“光合作用”、“蛋白降解”、“生物胁迫”和“非生物胁迫”等代谢过程。特别地,多个抗病基因（如IMPA1:PGSC0003DMG400014989;SPK1B:PGSC0003DMG400006184;WDR5B:PGSC0003DMG400019361）与SGA生物合成基因存在共表达现象。据此推断,马铃薯SGA生物合成过程可能在抗病中具有一定的调节作用。光照诱导过程中,28个RLKs差异表达,再次证明RLKs在环境适应中的调控作用。5.对前期研究筛选的抗病相关RLK亚家族SD-2b的一个成员SD-2b-1（PGSC0003DMG400031861）进行克隆和载体构建,并通过农杆菌渗入法分析该基因在马铃薯抵抗晚疫病菌中的作用。结果表明:注射含有重组质粒SD-2b-1-p FGC5941农杆菌的马铃薯叶片受到晚疫病菌（Pi）侵染时,病斑直径显着小于对照组,说明此基因在马铃薯晚疫病抗性中具有正调控作用;通过构建SD-2b-1和亚细胞定位载体YL322-d1-GFP的重组质粒,使其在拟南芥原生质体中表达,结果显示SD-2b-1位于细胞膜。
刘翠花[8]（2020）在《烟草NtVQ35基因的鉴定及其抗青枯病基本功能研究》文中研究表明由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的烟草青枯病,是对世界烟草产业具有经济重要性的细菌性病害,在热带、亚热带区域发生更为严重。VQ蛋白（FxxxVQxxTG）是植株中广泛存在的一类调节因子,不仅参与植物生长的各项生命过程,而且参与植物对逆境以及病原菌的胁迫应答。迄今,烟草vq基因家族包含哪些重要成员及其在抗烟草青枯病过程中发挥的作用尚不明确。因此,本研究首先利用生物信息学方法对烟草vq基因家族进行鉴定、系统分析其结构特征,并探索该家族成员在不同胁迫下的应答情况。经过系统筛选,筛选出NtVQ35基因。为了探索其在抗青枯病方面的功能,首先利用规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关基因（Cas9）技术（CRISPR/Cas9）和Gateway技术成功获得NtVQ35基因的编辑植株和过表达植株。然后对接种青枯病菌后的编辑植株、过表达株和野生型植株进行症状观察、病情指数统计和叶片内青枯病菌数目统计比较分析;同时对其进行比较转录组分析和水杨酸含量的测定,以期解析NtVQ35在抗青枯菌方面的作用机制。所获得的主要研究结果如下:1)探明烟草vq基因家族可分为I-VIII组,探索了几种处理的应答情况对烟草vq基因家族成员通过生物信息学方法进行系统挖掘和探索,并对其在激素【水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯利（ET）、脱落酸（ABA）、生长素（2,4D）】、非生物刺激（包括冷害、热害、伤害）以及病原菌（青枯病菌）处理下的应答情况进行系统分析,结果显示共预测得到59个烟草NtVQ蛋白,根据其氨基酸序列和所含有的多种保守结构域将其分为I-VIII组。其中II、IV、V、VI和VIII组成员可响应一种或多种激素。VII组不响应任何激素刺激。结构域相似的NtVQ基因对不同激素处理具有相似的响应模式。II和V组是响应ET处理最多的组,V组和VIII组是响应ABA最多的组。多数基因受到SA的诱导。温度处理中,NtVQ33和NtVQ34有明显的应答;而伤害处理中NtVQ32,NtVQ46和NtVQ58有明显的应答。半数以上的NtVQ基因受到烟草青枯病菌的诱导。研究发现NtVQ35基因能够同时被SA和青枯病菌高度诱导表达,对该基因的启动子区域分析,发现其启动子区域含有3个胁迫和防御响应相关的富含TC的重复序列。因此推测该基因可能在抗青枯病菌中发挥一定作用。2)初步明确vq基因家族代表基因NtVQ35负向调控烟草青枯病菌的侵染通过CRISPR技术和烟草叶盘法转基因技术成功获得烟草NtVQ35基因编辑植株遗传品系H4-8和H7-8,通过Gateway技术和烟草叶盘法转基因技术获得NtVQ35过表达遗传品系OE5、OE6和OE8。对获得的NtVQ35基因编辑株和过表达株进行表型观察,发现其跟野生型植株在生长发育上无明显差异,因此推测该基因不影响植株的生长和表型变化。对基因编辑株遗传品系H7-8、过表达株遗传品系OE6和野生型K326烟草分别接种青枯病菌,结果显示过表达植株遗传品系OE6在接种4 d后相较于野生型叶片发生明显萎蔫,病情指数为22.22%,编辑植株遗传品系H7-8相较于野生型植株症状上无特别明显变化,病情指数分别为0.55%,4.45%;9 d后,过表达植株OE6表现为叶片全部萎蔫并且茎基部颜色变黑,野生型植株表现为大部分叶片萎蔫,编辑植株H7-8表现约50%叶片出现萎蔫;过表达植株OE6、野生型植株K326和编辑植株H7-8病情指数分别为90%、71%、48.25%。此外,对接种青枯病菌后3 d的编辑植株H4-8遗传品系、过表达植株OE6遗传品系和野生型K326植株进行症状观察,发现OE6叶片接种部分发生明显的坏死和黄化,野生型接种部位出现明显的黄色晕圈,而H4-8接种部位也出现部分黄色晕圈,但相较于OE6和野生型植株表现不明显。对接种青枯病菌3 d后的叶片进行青枯菌数目的统计,可以看到在编辑植株H4-8中病菌数目最少,H7-8次之,在过表达植株OE6中病菌数目最多,表明编辑植株相较于过表达植株对青枯病菌的抗性更强。综上,NtVQ35在抗青枯病菌中发挥负向调控作用。3)探索了NtVQ35对青枯病菌负向调控作用可能与SA信号转导有关对接种青枯病菌1 d后的过表达植株遗传品系OE6、NtVQ35基因编辑植株遗传品系H4-8和野生型植株进行转录组测序分析比较,结果表明,KEGG通路中显着富集的与植物抗病性相关的代谢通路主要有黄酮类生物合成代谢途径、植物激素信号转导途径和植物-病原菌互作通路。具体表现为青枯病菌侵染后的编辑植株H4-8中与类黄酮类合成相关的基因表达量高于过表达植株OE6;在PTI途径,编码FLS2、环核苷酸门控通道蛋白（CNGC）的基因表达量显着高于过表达植株OE6,因此推测NtVQ35基因编辑株可能产生更强的基础性免疫;另一方面,在ETI途径,编辑植株H4-8中R基因RPS2相较于过表达植株,被高度诱导,说明其受到青枯病菌无毒基因Avr（效应蛋白）的激发程度高于过表达植株;编辑植株H4-8中SA、ET和BR途径的相关基因的表达量,也明显高于过表达植株,表明编辑植株相较于过表达株更抗青枯病。此外,为探索SA在烟草NtVQ35抗青枯病中发挥的作用,利用高效液相色谱法对接种青枯病菌4 d后的编辑植株H4-8、过表达植株OE6和野生型K326烟草植株中SA含量进行了测定和分析。结果表明,在青枯病菌接种4 d后,编辑植株叶片含有的游离态SA含量水平（656.9 ng/g）,显着高于野生型（204.6 ng/g）和过表达植株（164.2 ng/g）,因此表明NtVQ35对青枯病菌负向调控作用可能与SA信号转导有相关性。进一步的研究值得跟进。
迟超[9]（2019）在《小豆-锈菌（Uromyces vignae）互作的转录组分析及差异表达基因鉴定》文中研究说明小豆是我国传统的杂粮作物,是部分地区农民增收的重要来源,且在农业种植业结构调整的大背景下,小豆等杂粮作物的种植面积呈逐年增加趋势,黑龙江省是我国小豆种植面积最大的区域。然而,由豇豆单胞锈菌引起的小豆锈病在我国各小豆种植区普遍发生,课题组近年来的调查发现,黑龙江西部小豆产物该病害发生严重,已成为威胁小豆优质高产的重要因素之一。选育和利用抗病品种是防治作物锈病最为经济有效的措施之一,然而,有关小豆抗锈病基因及小豆抗锈病机理方面的研究相对滞后,致使缺少成熟的理论和技术成果用于小豆锈病的防治实践。因此,本研究拟利用RNA-Seq测序技术挖掘小豆抗锈病相关基因,筛选适宜于小豆基因表达分析的内参基因及qRT-PCR技术体系,在此基础上对候选的小豆抗锈病相关基因在病菌侵染不同阶段的表达模式进行分析,初步明确参与小豆抗锈病的基因,并对抗病相关基因VaEG45的功能进行初步分析,为深入探索小豆抗锈病分子机理及病害防控奠定基础。研究取得以下重要结果:1.利用转录组测序技术,分析了小豆抗病品种‘庆红1号’（QH1）在豇豆单胞锈菌接种后不同时间（24 h和48 h）的全转录组,以接种无菌水为对照,4个处理3次生物学重复计12个测序样本,共获得0.38-0.54 Gb不等的clean reads,经基因组mapping后进行差异表达基因分析,结果表明,接种后24 h共鉴定差异表达基因2973个,接种后48 h共鉴定差异表达基因856个,表明在病菌入侵早期即可显着诱导小豆产生防卫反应。差异表达基因的功能注释表明,接种后24 h,多个PR蛋白呈显着上调表达趋势。GO和KEGG富集分析发现,受病菌侵染后,小豆乙烯生物合成及乙烯信号通路的多个关键基因（ACS和ACO）及相关转录因子（ERF096、ERF1b、ERF110、ERF113、EBF1）被激活,表明锈菌侵染可能引起了小豆内源乙烯含量的改变,进而激活了乙烯抗病信号通路,这可能是小豆品种QH1高抗锈病的重要因素。2.为构建适宜小豆基因表达的qRT-PCR技术体系及稳定内参,选取了9个常用的管家基因为候选内参,对候选内参基因在不同试验条件下表达稳定性进行了分析,试验结果表明,在不同小豆品种中,可选择ACT或PTB作为内参基因;在同一品种不同组织器官中,可选择EF或UBN作为内参;在接种锈菌和干旱胁迫条件下,ACT或ZMPP可作为内参基因;在盐碱胁迫条件下,可选择UBC或Fbox作为内参;在淹水胁迫条件下,可选择PTB或Fbox作为内参基因。为进一步确定本研究筛选的内参基因的可靠性,分别以ACT、基因组合UNC+UBN、UBC+UBN+EF以及PP2A为内参,对抗病相关基因CAT、CHI及GLU在小豆响应锈菌侵染过程中的表达模式进行了分析,结果表明,接种锈菌条件下以ACT为内参可准确评估候选3个抗病相关基因的表达水平,说明经本研究筛选获得的内参基因较为可靠,可用于小豆基因在相应试验条件下的表达分析。3.应用前文建立的小豆qRT-PCR分析体系及筛选获得的最适内参,以抗、感不同品种接种锈菌后不同时间的叶片为材料,对转录组测序鉴定的于接种后显着差异表达的2个抗病相关基因（VaNATA1和VaEG45）的表达模式进行了分析,结果表明,与感病品种相比,VaNATA1和VaEG45在抗病品种中受病菌侵染后被显着诱导表达,其中VaNATA1在病菌侵染早期（接种后12 h-24 h）和后期（120 h）显着上调表达,而VaEG45主要在病菌侵染后期（接种后48 h-120 h）显着上调,表明VaNATA1参与了对病菌入侵和扩展的抑制作用,而VaEG45只参与了对病菌扩展的抑制。上述结果表明,以转录组测序为依据,结合qRT-PCR分析初步明确了VaNATA1和VaEG45的表达水平与小豆抗锈病呈正相关。4.采用RT-PCR技术,克隆了抗病相关基因VaEG45,对其氨基酸序列分析的结果表明,VaEG45属于植物利钠肽家族基因,包含一个DPBB1功能域,是一个分泌型胞外蛋白。在烟草中瞬时表达后发现,瞬时表达VaEG45的烟草叶片的病斑直径显着降低,比对照降低了近40%,表明该基因显着提高了烟草对灰霉菌侵染的抗性。进一步应用胼胝质染色技术分析发现,VaEG45基因瞬时表达,可诱发烟草叶肉细胞出现胼胝质沉积,推测VaEG45可能通过增强细胞壁的机械强度从而提高烟草对灰霉菌的抗性。
梅琼[10]（2019）在《高抗水稻白叶枯病相关新基因的克隆及抗病机制研究》文中认为水稻白叶枯病是由Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xoo）引起的一种毁灭性病害,可造成水稻大量减产。抗病品种的利用是一种经济且对环境友好的防治手段,但是其前提是需要不断挖掘新的抗白叶枯病基因资源并明确抗病基因功能。本研究利用前期诱变获得的广谱高抗白叶枯病的水稻类病变突变体hpil3开展了抗病目标基因定位、克隆,蛋白组学,目标基因的互作基因筛选等相关研究,同时对疣粒野生稻中RCA在抗白叶枯病中的作用机理进行了研究。主要研究成果如下:利用hpil3和其野生型大粒香水稻通过基于重测序的图位克隆策略成功定位并克隆了该突变体的目标基因。该基因定位在4号染色体的20-22Mb区域内,进一步筛选得到7个候选的基因。通过对突变位点的验证和生物信息学分析最终确定了一个可能性较大的候选基因。转基因功能互补验证结果表明,该野生型基因成功使hpil3的表型恢复为野生型并丧失了对白叶枯病的抗性,从而确证了该候选基因就是hpil3的目标基因。通过实时荧光定量PCR发现hpil3中病程相关基因PR1a、PR1b、PR5、PR10表达量显着高于其野生型大粒香（DLX）,而PR9略高于DLX;未接病菌的hpil3体内的HPIL3表达量显着高于野生型,这可能是由于基因突变导致的功能丧失从而使植株提高了该基因的表达量;突变体中HPIL3的表达量受白叶枯病菌诱导表达,且接菌后该基因表达量迅速升高,分析认为该基因与水稻抗白叶枯病具有相关性。对hpil3和DLX不同叶位进行荧光差异双向凝胶电泳结合质谱分析鉴定了291个差异表达倍数≥1.5倍且t-test≤0.05的蛋白,其中74个蛋白上调,217个蛋白下调。这些蛋白功能涉及氨基酸/蛋白代谢和修饰、光合作用、核苷酸代谢、防御相关、能量代谢、糖代谢、氧化还原等。进一步的数据分析显示hpil3多种主要的代谢途径如光合作用、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、卡尔文循环相关酶的表达量大多跟hpil3类病变表型发生程度呈负相关。一些抗病相关蛋白如PR10、14-3-3蛋白上调,而负调控细胞凋亡的AAA-type ATP酶下调,同时抗氧化的酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化物酶（POD）上调,这些结果表明hpil3植株体内产生了抗性反应,与此同时各种相关代谢途径也受到影响,为了保持细胞稳态,ROS清除系统也在发挥积极的作用。采用酵母双杂交筛选到四个hpil3目标基因的互作基因。这些互作基因经过了基因全长的酵母双杂验证。其中质体蓝素和光系统Ⅱ的23kDa多肽是叶绿体蛋白。另外两个蛋白其中一个是包含C末端结构域的YL1核蛋白和一个胁迫应答蛋白。推测hpil3目标基因的突变导致编码蛋白不能与相关蛋白互作从而介导了下游抗病信号途径的激活。接种Xoo的疣粒野生稻产生的大量H2O2可诱导叶片内RCA与类囊体膜的结合。本研究发现接种Xoo会诱导疣粒野生稻发生H2O2的迸发,且氧化迸发的时间段和RCA从叶绿体基质向类囊体膜转移的时间段高度吻合,这暗示了二者存在某种关系。H2DCFDA染色试验发现生成的H2O2积累在叶片的叶绿体。进一步体外实验表明H2O2可诱导疣粒野生稻RCA的转移,且这种转移是疣粒野生稻特异的,混合疣粒野生稻和栽培稻大粒香得叶绿体组分不会发生这种转移。综上所述,本文利用基于二代基因组测序的图位克隆策略,克隆了并通过转基因功能互补确证了hpil3的目标基因,结果表明HPIL3的突变和功能缺失导致了水稻叶片类病变表型,既HPIL3负调控水稻叶片细胞程序性死亡和类病变表型;实时荧光定量PCR研究结果表明hpil3叶片多个抗病相关基因显着上调;蛋白质组学的研究表明HPIL3通过多种途径参与调节水稻类病变的形成;进一步通过酵母双杂交筛选获得了HPIL3的4个候选互作基因;疣粒野生稻可能通过核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco activase,RCA）与类囊体膜的结合从而避免其受到激增的H2O2伤害,说明RCA除了我们通常所知的调节光合作用外也可能在疣粒野生稻抗Xoo中发挥作用。本研究为水稻抗白叶枯病机制的深入研究以及水稻抗病育种提供了重要的基因资源和前期理论基础。
二、mRNADD-PCR技术及其在植物抗病基因研究中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、mRNADD-PCR技术及其在植物抗病基因研究中的应用（论文提纲范文）
（1）假茄科雷尔氏菌对瓜类作物的致病性以及南瓜响应病菌侵染的转录组和代谢组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 植物青枯菌的寄主范围 |
| 1.2 葫芦科植物青枯病的研究概述 |
| 1.3 病菌与植物寄主互作的机制概述 |
| 1.4 转录组学在植物抗病机制研究中的应用 |
| 1.5 代谢组学在植物抗病机制研究中的应用 |
| 1.6 转录组学和代谢组学关联分析在植物抗病研究中的应用 |
| 1.7 本研究的目的意义 |
| 1.8 本研究的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 供试培养基 |
| 2.1.3 主要试剂盒 |
| 2.1.4 供试作物 |
| 2.1.5 主要试验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 不同寄主来源青枯菌菌株对瓜类作物的致病性测定 |
| 2.2.2 Cq01 和GMI1000 菌株侵染对南瓜防御相关生理生化反应影响的测定 |
| 2.2.3 南瓜响应Cq01 和GMI1000 菌株侵染的转录组测序分析 |
| 2.2.4 南瓜响应Cq01 和GMI1000 菌株侵染的代谢组分差异分析 |
| 2.2.5 数据处理方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 青枯菌对瓜类作物的致病性 |
| 3.1.1 不同寄主来源菌株对3 种瓜类作物的致病性 |
| 3.1.2 菌株所属的生理小种类型 |
| 3.1.3 对南瓜具有无致病性和强致病力的菌株 |
| 3.1.4 Cq01 和GMI1000 菌株在南瓜根系的侵入菌量 |
| 3.2 Cq01 和GMI1000 菌株对南瓜防御相关的生理生化特性的影响 |
| 3.2.1 H_2O_2的变化 |
| 3.2.2 过敏性坏死细胞检测结果 |
| 3.2.3 Cq01和GMI1000 菌株对南瓜植株MAD含量的影响 |
| 3.2.4 Cq01和GMI1000 菌株对南瓜植株PAL酶活性的影响 |
| 3.2.5 Cq01和GMI1000 菌株对南瓜植株POD酶活性的影响 |
| 3.2.6 Cq01和GMI1000 菌株对南瓜植株SOD酶活性的影响 |
| 3.2.7 Cq01和GMI1000 菌株对南瓜植株PPO酶活性的影响 |
| 3.2.8 Cq01和GMI1000 菌株对南瓜植株CAT酶活性的影响 |
| 3.3 南瓜响应Cq01 和GMI1000 菌株侵染的转录组测序分析 |
| 3.3.1 RNA质量检测分析 |
| 3.3.2 测序数据和组装结果分析 |
| 3.3.3 基因表达分析 |
| 3.3.4 差异表达基因筛选 |
| 3.3.5 差异表达基因GO注释 |
| 3.3.6 差异表达基因KEGG注释 |
| 3.3.7 qRT-PCR验证差异表达基因 |
| 3.4 南瓜响应Cq01 和GMI1000 菌株侵染的代谢组分析 |
| 3.4.1 主成分分析 |
| 3.4.2 正交偏最小二乘法-判别分析 |
| 3.4.3 差异代谢物的筛选 |
| 3.4.4 差异代谢物的KEGG注释 |
| 3.4.5 转录组和代谢组关联分析 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 青枯菌对瓜类作物的致病性及其生理小种 |
| 4.1.2 Cq01 和GMI1000 菌株对南瓜生理生化特性的影响 |
| 4.1.3 南瓜响应Cq01 和GMI1000 菌株侵染的转录组测序分析 |
| 4.1.4 南瓜响应Cq01 和GMI1000 菌株侵染的代谢组分析 |
| 4.1.5 南瓜响应Cq01 和GMI1000 菌株侵染的转录组和代谢组关联分析 |
| 4.2 结论 |
| 4.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（2）红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 红三叶主要病虫害、作物白粉病及病原菌鉴定的研究进展 |
| 2.1 红三叶主要病虫害 |
| 2.2 白粉病研究进展 |
| 2.3 病原菌鉴定研究进展 |
| 3 寄主植物-病原菌互作的转录组学研究进展 |
| 3.1 转录组学 |
| 3.2 转录组学在寄主植物与病害研究中的进展 |
| 4 植物抗病机制与GDSL脂肪酶的研究进展 |
| 4.1 作物病害生理生化反应研究进展 |
| 4.2 植物结构抗性研究进展 |
| 4.3 植物内源激素抗病性响应研究进展 |
| 4.4 GDSL脂肪酶基因研究进展 |
| 5 选题依据与意义 |
| 5.1 选题依据 |
| 5.2 主要研究内容 |
| 5.3 主要技术路线 |
| 第二章 红三叶抗白粉病的生理响应机制 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶白粉菌分离、鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 病害症状观察 |
| 1.3 病原菌形态学观察 |
| 1.4 病原菌rDNA-ITS片段的PCR扩增和序列测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病害症状与病原菌形态特征观察 |
| 2.2 rDNA ITS片段的扩增与测序 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 红三叶抗白粉病生理基础 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及仪器 |
| 1.2 测定方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单因素处理间红三叶的生理生化差异 |
| 2.2 二因素交互作用间红三叶的生理生化差异 |
| 2.3 人工接菌×抗病性×接菌后时间交互作用间红三叶生理生化的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三节 白粉菌侵染后红三叶内源激素的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 测定项目与方法 |
| 1.3 色谱条件及流动相的选择 |
| 1.4 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 标准样品保留时间?回归方程和决定系数 |
| 2.2 单因素处理间各内源激素的差异 |
| 2.3 二因素交互作用间各内源激素的差异 |
| 2.4 人工接菌×抗病性×浸染时间交互作用间红三叶内源激素的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 红三叶响应白粉菌侵染的结构抗病性 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶抗白粉病的细胞结构变化规律 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 白粉病不同抗性红三叶叶片显微结构 |
| 2.2 不同红三叶抗性材料叶片组织结构特征 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 白粉菌侵染后红三叶叶片细胞壁成份变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单因素处理间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 2.2 二因素交互作用间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 2.3 人工接菌×抗病性×浸染时间交互作用间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 红三叶抗白粉病的分子机制及TpGDSL基因的克隆与遗传转化 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶抗白粉病的转录组分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料与试验设计 |
| 1.2 测序样品准备和RNA提取 |
| 1.3 建库、测序及信息分析 |
| 1.4 测序数据质控与转录组组装 |
| 1.5 Unigene的注释 |
| 1.6 差异表达基因数字分析 |
| 1.7 基因功能注释及通路富集 |
| 1.8 差异表达基因的qRT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA-seq结果的实时定量PCR验证 |
| 2.2 转录组组装与注释 |
| 2.3 差异表达基因(DEGs)分析 |
| 2.4 接种白粉菌后DEGs的GO富集分析 |
| 2.5 接种白粉菌后DEGs的KEGG富集分析 |
| 2.6 白粉菌侵染红三叶叶片诱导的 DEGs的 Map Man分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 红三叶抗白粉病TpGDSL基因克隆与遗传转化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 红三叶TpGDSL基因克隆 |
| 1.2.2 构建表达载体 |
| 1.2.3 红三叶抗白粉病基因TpGDSL遗传转化拟南芥 |
| 1.2.4 拟南芥T_1代阳性植株鉴定 |
| 1.2.5 目的基因生物信息学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TpGDSL基因阳性克隆鉴定 |
| 2.2 TpGDSL基因的核苷酸序列分析 |
| 2.3 TpGDSL基因编码蛋白的一级结构分析 |
| 2.4 TpGDSL基因编码蛋白的二级结构分析 |
| 2.5 TpGDSL基因编码蛋白的三级结构分析 |
| 2.6 TpGDSL基因克隆与表达载体构建 |
| 2.7 转基因拟南芥T_1阳性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 结论与研究展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（3）尖孢镰刀菌SIX效应基因进化关系及其在侵染紫花苜蓿过程中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 尖孢镰刀菌研究进展 |
| 2.1.1 尖孢镰刀菌致病机理 |
| 2.1.2 尖孢镰刀菌对紫花苜蓿的危害 |
| 2.1.3 尖孢镰刀菌防治方法 |
| 2.2 尖孢镰刀菌SIX效应基因 |
| 2.2.1 效应基因 |
| 2.2.2 尖孢镰刀菌不同专化型菌株的SIX同源基因 |
| 2.2.3 尖孢镰刀菌同一专化型菌株的SIX基因 |
| 2.2.4 SIX基因编码的效应蛋白 |
| 2.3 实时荧光定量PCR技术在植物中定量尖孢镰刀菌的应用 |
| 2.3.1 实时荧光定量PCR技术定量尖孢镰刀菌生物量 |
| 2.3.2 实时荧光定量PCR技术定量效应基因表达量 |
| 2.4 本研究的目的和意义 |
| 第三章 尖孢镰刀菌不同寄主专化型SIX基因 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 基因序列比对与筛选 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 SIX同源基因序列比对与筛选 |
| 3.2.2 SIX同源基因进化树分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 尖孢镰刀菌在侵染苜蓿过程中的生物量 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试材料 |
| 4.1.2 样品采集 |
| 4.1.3 根部组织总RNA提取 |
| 4.1.4 RNA的质量检测 |
| 4.1.5 RNA反转录合成cDNA |
| 4.1.6 实时荧光定量PCR体系摸索 |
| 4.1.7 实时荧光定量PCR |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 苜蓿接种尖孢镰刀菌后的表观症状 |
| 4.2.2 苜蓿接种尖孢镰刀菌后的病情指数 |
| 4.2.3 实时荧光定量PCR体系建立 |
| 4.2.4 苜蓿接种尖孢镰刀菌后不同时间点生物量 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 尖孢镰刀菌侵染苜蓿过程中SIX基因表达 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试材料 |
| 5.1.2 样品采集 |
| 5.1.3 Trizol法提取流程RNA和质量检测 |
| 5.1.4 反转录合成c DNA和实时荧光定量PCR体系建立 |
| 5.1.5 实时荧光定量PCR |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 实时荧光定量PCR体系建立 |
| 5.2.2 尖孢镰刀菌侵染不同苜蓿品种后SIX基因相对表达量 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（4）真菌胁迫响应TaNAC基因和小麦杂种衰亡分子机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 小麦条锈病与白粉病 |
| 1.1.1 小麦抗条锈病基因和抗白粉病基因的研究 |
| 1.1.2 小麦抗条锈病和白粉病的其他研究 |
| 1.2 植物NAC转录因子 |
| 1.2.1 植物NAC转录因子简介 |
| 1.2.2 植物激素参与的NAC转录因子调控 |
| 1.2.3 NAC转录因子的调控作用 |
| 1.2.4 小麦NAC转录因子(TaNAC)的研究现状 |
| 1.3 植物中的杂种衰亡 |
| 1.3.1 植物中杂种衰亡的简介 |
| 1.3.2 杂种衰亡的可能原因和调控机制 |
| 1.3.3 远缘杂交与基因互作 |
| 1.3.4 小麦中的杂种衰亡 |
| 1.4 分子标记开发及多组学研究方法 |
| 1.4.1 分子标记技术的发展与分子标记开发 |
| 1.4.2 多组学研究方法 |
| 1.5 研究方案 |
| 1.5.1 选题目的及意义 |
| 1.5.2 研究内容和方案 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第二章 TaNAC TFs参与调节小麦对白粉病和条锈病的抗性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 植物材料和处理 |
| 2.2.2 RNA提取与基因克隆 |
| 2.2.3 筛选真菌胁迫响应相关的TaNAC基因 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR分析 |
| 2.2.5 普通小麦NAC转录因子基因家族重鉴定和序列分析 |
| 2.2.6 TaNAC转录因子的系统进化及蛋白序列特征分析 |
| 2.2.7 基因及其编码产物的序列结构、理化性质等生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 基于IWGSC Ref Seq v1.1 对小麦NAC转录因子基因家族重鉴定 |
| 2.3.2 基于转录组数据筛选并分析真菌胁迫响应的TaNAC基因 |
| 2.3.3 从真菌胁迫后的N9134 中克隆TaNAC基因并重命名新转录本 |
| 2.3.4 获得的TaNAC转录本及其编码产物的序列结构、理化性质等分析 |
| 2.3.5 白粉菌和条锈菌侵染下小麦TaNAC基因的表达分析 |
| 2.3.6 真菌胁迫下N9134中TaNAC转录本的结构变体 |
| 2.3.7 真菌胁迫下差异表达TaNAC转录因子的结构特征分析 |
| 2.3.8 TaNAC膜结合转录因子(Membrane-bound TFs,MTFs)的比较分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 时空特异表达和可变剪切表明:TaNAC转录本可进一步丰富和完善 |
| 2.4.2 小规模复制或删除事件有助于丰富TaNAC基因及其转录本序列结构变异的多样性 |
| 2.4.3 膜结合TaNAC通过形成不同结构变体的调控方式发挥不同的功能 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 TaNAC基因基于可变剪切和miRNA的转录后调控参与真菌胁迫响应 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料和处理 |
| 3.2.2 RNA提取与基因克隆 |
| 3.2.3 实时荧光定量PCR分析TaNAC结构变异转录本差异表达 |
| 3.2.4 洋葱表皮细胞瞬时表达分析亚细胞定位 |
| 3.2.5 转录调控活性分析 |
| 3.2.6 生物信息学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 一对TaNAC可变剪切结构变异转录本在白粉菌胁迫下的表达分析 |
| 3.3.2 克隆得到TaNAC可变剪切转录本的序列结构分析 |
| 3.3.3 TaNAC结构变异转录本编码产物的结构特征和理化性质分析 |
| 3.3.4 TaNAC可变剪切结构变异转录本编码产物的高级结构分析 |
| 3.3.5 比对分析TaNAC结构变异转录本的亚细胞定位 |
| 3.3.6 比较分析TaNAC结构变异转录本的转录调控活性 |
| 3.3.7 结合于小麦TaNAC基因编码区的mi RNA的预测分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 TaNAC基因可以通过可变剪切的转录后调控方式参与胁迫响应 |
| 3.4.2 TaNAC基因可变剪切和mi RNA耦联的转录后调控 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 小麦杂种衰亡调控基因的精细定位及其在我国的分布与演化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 等位性测验 |
| 4.2.3 表型调查和数据分析 |
| 4.2.4 取样和提取基因组DNA |
| 4.2.5 分子标记的筛选和开发 |
| 4.2.6 绘制遗传图谱 |
| 4.2.7 杂种衰亡相关小麦材料的系谱分析和基因型检测 |
| 4.2.8 荧光原位杂交(FISH) |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 分析验证本研究冬小麦群体中存在的杂种衰亡 |
| 4.3.2 中度和重度杂种衰亡系统中也存在Ne基因的剂量效应 |
| 4.3.3 杂种衰亡调控基因Ne1 和Ne2 的复等位基因确实分别存在不同 |
| 4.3.4 构建冬小麦杂种衰亡调控基因Ne1 和Ne2 的高密度遗传图谱 |
| 4.3.5 杂种衰亡调控基因Ne1 和Ne2 在中国各麦区离散的分布特征 |
| 4.3.6 N9134 和周麦22 中杂种衰亡调控基因Ne1 和Ne2 的来源 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 F_1 与亲本的千粒重百分比更适合为杂种衰亡分级标准之一 |
| 4.4.2 遗传背景应该是杂种衰亡表型差异的另一个影响因素 |
| 4.4.3 普通小麦的Ne1 和Ne2 可能分别直接源于野生二粒小麦和黑麦 |
| 4.4.4 N9134 的Ne1 和周麦22 的Ne2 可能是杂种衰亡调控新基因 |
| 4.4.5 引进品种直接影响中国现代品种杂种衰亡基因频率(尤其Ne2) |
| 4.4.6 导致杂种衰亡的基因位点也可以对小麦育种起积极作用 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 小麦杂种衰亡调控机制的多组学分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 多组学分析的植物材料 |
| 5.2.2 基于BSA的转录组测序(BSR) |
| 5.2.3 基于PacBio三代平台的全长转录组测序 |
| 5.2.4 iTRAQ定量蛋白质组测序 |
| 5.2.5 广泛靶向代谢组分析 |
| 5.2.6 多组学联合分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 小麦杂种衰亡的BSR分析 |
| 5.3.2 小麦杂种衰亡的全长转录组分析 |
| 5.3.3 小麦杂种衰亡的定量蛋白质组学分析 |
| 5.3.4 小麦杂种衰亡的代谢组学分析 |
| 5.3.5 基于转录组、蛋白质组和代谢组的多组学联合分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 各组学分析结果及多组学联合分析结果的问题与不足 |
| 5.4.2 小麦中杂种衰亡、真菌病害抗性、TaNAC转录因子三者的关系 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 附文 |
| 附录B 附表 |
| 附录C 附图 |
| 致谢 |
| 博士毕业有感 |
| 作者简介 |
（5）宿根矮化病菌侵染甘蔗的生理与分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 甘蔗宿根矮化病 |
| 1.1.1 甘蔗宿根矮化病的发生、症状及危害 |
| 1.1.2 甘蔗宿根矮化病的病原菌 |
| 1.1.3 甘蔗宿根矮化病的传播及致病机理 |
| 1.1.4 甘蔗宿根矮化病的检测 |
| 1.1.5 甘蔗宿根矮化病的防治 |
| 1.1.6 甘蔗宿根矮化病病原菌的基因组学研究 |
| 1.2 植物与病原菌互作机制 |
| 1.2.1 植物与病原菌互作的形态及细胞学变化 |
| 1.2.2 植物与病原菌互作的生化及分子机制 |
| 1.3 植物应答病原菌侵染的转录组、蛋白组及蛋白质修饰组学研究 |
| 1.3.1 转录组学 |
| 1.3.2 蛋白质组学 |
| 1.3.3 转录组学与蛋白质组学的关联研究 |
| 1.3.4 蛋白修饰组学 |
| 1.4 立题依据与研究意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 宿根矮化病菌侵染对甘蔗生长代谢的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 制备Lxx接种菌液 |
| 2.1.2 种植材料与接种 |
| 2.1.3 测定项目与方法 |
| 2.1.3.1 基于实时荧光定量PCR和 Western Blot检测甘蔗宿根矮化病 |
| 2.1.3.2 甘蔗农艺性状测定 |
| 2.1.3.3 水势、膜透性、游离氨基酸含量测定 |
| 2.1.3.4 可溶性糖、水分含量测定 |
| 2.1.3.5 半胱氨酸、甲硫氨酸、钙调素含量测定 |
| 2.1.3.6 防御相关基因表达量测定方法 |
| 2.1.4 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 甘蔗茎中RNA提取及荧光定量引物的筛选 |
| 2.2.2 Lxx接种后不同时期甘蔗体内的Lxx18460 基因表达 |
| 2.2.3 甘蔗茎中蛋白质质量 |
| 2.2.4 不同时期RSD染病甘蔗体内Lxx18460 蛋白表达 |
| 2.2.5 Lxx侵染对甘蔗农艺性状的影响 |
| 2.2.6 Lxx接种对甘蔗叶片水势、膜透性、游离氨基酸含量影响 |
| 2.2.7 Lxx接种对甘蔗可溶性糖和水分含量的影响 |
| 2.2.8 Lxx接种对甘蔗叶片半胱氨酸、甲硫氨酸、钙调素含量的影响 |
| 2.2.9 Lxx接种对甘蔗叶片PAL、ZFP和 NBS-LRR基因表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 宿根矮化病菌侵染对甘蔗叶片细胞壁组分的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 种植及处理 |
| 3.1.3 测定项目及方法 |
| 3.1.3.1 甘蔗RSD确诊及取样 |
| 3.1.3.2 细胞壁组分的测定 |
| 3.1.4 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 DNA提取结果 |
| 3.2.2 PCR检测结果 |
| 3.2.3 Lxx接种对甘蔗叶片纤维素含量的影响 |
| 3.2.4 Lxx接种对甘蔗叶片半纤维素含量的影响 |
| 3.2.5 Lxx接种对甘蔗叶片果胶含量的影响 |
| 3.2.6 Lxx接种对甘蔗叶片胼胝质含量的影响 |
| 3.2.7 Lxx接种对甘蔗叶片木质素含量的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 宿根矮化病菌侵染对甘蔗干物质及氮磷钾含量的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 样品采集及处理 |
| 4.1.3 测定项目及方法 |
| 4.1.3.1 甘蔗全氮含量测定 |
| 4.1.3.2 甘蔗全磷含量测定 |
| 4.1.3.3 甘蔗全钾含量测定 |
| 4.1.4 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 Lxx接种对甘蔗地上部分干物质积累量的影响 |
| 4.2.2 Lxx接种对甘蔗全氮的影响 |
| 4.2.3 Lxx接种对甘蔗全磷的影响 |
| 4.2.4 Lxx接种对甘蔗全钾的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 甘蔗应答宿根矮化病菌的转录组分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 材料种植与处理 |
| 5.1.3 转录组测序文库的构建 |
| 5.1.4 高通量测序数据基本分析与处理 |
| 5.1.4.1 CDS预测与SSR分析 |
| 5.1.4.2 基因注释 |
| 5.1.5 转录本表达量分析与基因表达差异分析 |
| 5.1.6 GO和 KEGG通路富集分析 |
| 5.1.7 qRT-PCR检测分析 |
| 5.1.8 数据获取 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 测序数据质控 |
| 5.2.2 转录组组装 |
| 5.2.3 CDS及 SSR分析 |
| 5.2.4 甘蔗转录组注释 |
| 5.2.5 差异表达基因分析 |
| 5.2.5.1 Lxx侵染后差异表达基因的数量分析 |
| 5.2.5.2 差异基因的GO功能富集 |
| 5.2.5.3 差异基因的KEGG Pathway功能富集 |
| 5.2.6 差异表达基因的个性化分析 |
| 5.2.6.1 Lxx侵染后差异表达基因的功能分析 |
| 5.2.6.2 甘蔗响应Lxx侵染的差异表达基因 |
| 5.2.7 荧光定量实验 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 甘蔗应答宿根矮化病菌侵染的蛋白质组研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 蛋白质提取 |
| 6.1.3 蛋白质定量与SDS-PAGE单向电泳 |
| 6.1.4 蛋白质组测序实验流程 |
| 6.1.4.1 蛋白酶解 |
| 6.1.4.2 High pH RP分离和高效液相 |
| 6.1.4.3 DDA(data-dependent acquisition)质谱检测 |
| 6.1.4.4 DIA质谱检测 |
| 6.1.5 蛋白组数据信息分析流程 |
| 6.1.5.1 数据库选择 |
| 6.1.5.2 DDA数据分析 |
| 6.1.5.3 DIA数据分析 |
| 6.1.5.4 MSstats差异分析 |
| 6.1.5.5 各个数据库项目的注释 |
| 6.1.5.6 差异蛋白的功能注释 |
| 6.1.6 MRM分析 |
| 6.1.6.1 蛋白质提取、质控、酶解、高效液相分离 |
| 6.1.6.2 质谱检测 |
| 6.1.6.3 MRM实验数据及生信分析流程 |
| 6.1.7 蛋白质组与转录组关联分析 |
| 6.1.7.1 关联分析流程 |
| 6.1.7.2 蛋白质组与转录组关联分析参数设置 |
| 6.1.7.3 关联数据分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 蛋白质检测 |
| 6.2.2 蛋白质组数据鉴定 |
| 6.2.2.1 蛋白质组基本鉴定信息 |
| 6.2.2.2 肽段质量评估 |
| 6.2.2.3 蛋白质组的整体分布分析 |
| 6.2.3 蛋白注释 |
| 6.2.3.1 GO分析 |
| 6.2.3.2 KOG分析 |
| 6.2.3.3 Pathway分析 |
| 6.2.4 差异表达蛋白统计分析 |
| 6.2.4.1 差异表达蛋白GO富集分析 |
| 6.2.4.2 差异表达蛋白的Pathway富集分析 |
| 6.2.4.3 差异表达蛋白KOG注释 |
| 6.2.4.4 差异表达蛋白亚细胞定位 |
| 6.2.5 样本中目标差异蛋白的MRM验证 |
| 6.2.5.1 MRM定量信息 |
| 6.2.5.2 目标蛋白相对定量 |
| 6.2.6 蛋白质组与转录组的关联分析 |
| 6.2.6.1 二个组学关联的数量信息 |
| 6.2.6.2 蛋白组与转录组的相关性分析 |
| 6.2.6.3 关联差异蛋白分析 |
| 6.2.6.4 GO富集关联数量统计 |
| 6.2.6.5 GO富集关联相关性分析 |
| 6.2.6.6 Pathway富集关联数量统计 |
| 6.2.6.7 Pathway富集关联相关性分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 甘蔗应答宿根矮化病菌侵染的磷酸化蛋白组学分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验材料 |
| 7.1.2 蛋白质提取 |
| 7.1.3 蛋白样品质控 |
| 7.1.4 实验流程 |
| 7.1.5 数据分析 |
| 7.1.5.1 iTRAQ定量磷酸化蛋白质组学的基本信息分析流程 |
| 7.1.5.2 磷酸化蛋白鉴定与定量 |
| 7.1.5.3 磷酸化蛋白组功能分析 |
| 7.1.5.4 差异磷酸化蛋白的富集分析 |
| 7.1.6 PRM验证 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 磷酸化蛋白组鉴定 |
| 7.2.1.1 磷酸化蛋白组鉴定统计 |
| 7.2.1.2 磷酸化蛋白组鉴定数据评估 |
| 7.2.1.3 磷酸化位点统计 |
| 7.2.1.4 定量重复性评估 |
| 7.2.2 磷酸化蛋白组功能分析 |
| 7.2.2.1 GO注释分析 |
| 7.2.2.2 KEGG代谢通路注释分析 |
| 7.2.2.3 COG注释分析 |
| 7.2.3 差异磷酸化蛋白组功能分析 |
| 7.2.3.1 差异磷酸化肽段统计 |
| 7.2.3.2 差异磷酸化蛋白的GO富集分析 |
| 7.2.3.3 差异磷酸化蛋白的Pathway富集分析 |
| 7.2.3.4 差异磷酸化蛋白互作网络分析 |
| 7.2.3.5 差异磷酸化蛋白的亚细胞定位分析 |
| 7.2.4 样本中目标差异磷酸化肽段的PRM验证 |
| 7.2.4.1 PRM定量信息 |
| 7.2.4.2 目标磷酸化肽段相对定量 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 转基因烟草的Lxx18460 基因功能分析 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 试验材料与试剂 |
| 8.1.2 种植和处理 |
| 8.1.3 转基因烟草的DNA提取与PCR检测 |
| 8.1.4 转基因烟草的蛋白质提取与Western Blot检测 |
| 8.1.5 农艺性状的测定 |
| 8.1.6 光合速率的测定 |
| 8.1.7 防御酶活性的测定 |
| 8.1.8 内源激素含量的测定 |
| 8.1.9 Lxx18460 基因在转基因烟草中的表达 |
| 8.1.10 Western Blot检测不同时间Lxx18460 蛋白质的表达 |
| 8.1.11 转Lxx18460 基因烟草基因差异表达分析 |
| 8.1.12 生理数据分析 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 转基因烟草TI代的PCR检测 |
| 8.2.2 转基因烟草TI代的Western Blot检测 |
| 8.2.3 转基因烟草植株与野生型烟草植株的表型观察 |
| 8.2.4 转基因烟草植株与野生型烟草植株的株高、叶面积和净光合速率 |
| 8.2.5 防御酶活性在转基因和野生型烟草植株中的变化 |
| 8.2.6 内源激素含量在转基因和野生型烟草植株中的变化 |
| 8.2.7 Lxx18460 基因在转基因植株中的表达情况 |
| 8.2.8 Lxx18460 蛋白在转基因植株中的表达情况 |
| 8.2.9 转Lxx18460 烟草与野生型烟草的差异表达基因分析 |
| 8.2.10 RT-PCR验证 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 转Lxx18460 甘蔗的遗传转化 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 植物材料 |
| 9.1.2 菌种及质粒 |
| 9.1.3 试剂 |
| 9.1.4 主要仪器设备 |
| 9.1.5 培养基及溶液的配置 |
| 9.1.6 目的基因获得 |
| 9.1.6.1 引物设计 |
| 9.1.6.2 目的基因的扩增 |
| 9.1.7 构建重组载体p UBTC–Lxx18460 |
| 9.1.7.1 连接p MD18-T载体及转化E.coli感受态细胞 |
| 9.1.7.2 检测阳性克隆菌株 |
| 9.1.7.3 质粒的提取 |
| 9.1.7.4 单子叶植物表达载体和目的基因的双酶切 |
| 9.1.7.5 目的基因Lxx18460 连接单子叶表达载体p UBTC |
| 9.1.7.6 转化E.coli感受态细胞及挑选阳性克隆菌株 |
| 9.1.7.7 农杆菌感受态细胞EHA105 的转化 |
| 9.1.7.8 重组子转化EHA105 后单菌落PCR验证 |
| 9.1.8 农杆菌介导法转化甘蔗 |
| 9.1.8.1 甘蔗转化材料的培养 |
| 9.1.8.2 农杆菌侵染液的制备 |
| 9.1.8.3 甘蔗愈伤侵染转化 |
| 9.1.8.4 甘蔗愈伤转化后的培养 |
| 9.1.9 转基因阳性植株的PCR检测 |
| 9.1.9.1 甘蔗DNA的提取 |
| 9.1.9.2 转基因甘蔗的PCR检测 |
| 9.1.9.3 转基因甘蔗的Western Blot检测 |
| 9.2 结果与分析 |
| 9.2.1 目的基因的获得 |
| 9.2.2 载体构建和重组质粒双酶切验证 |
| 9.2.3 重组质粒转化农杆菌检测 |
| 9.2.4 转基因甘蔗的获得 |
| 9.2.5 甘蔗DNA提取与转基因植株PCR检测 |
| 9.2.6 转基因甘蔗Western Blot检测 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 第十章 总结与展望 |
| 10.1 全文总结 |
| 10.2 全文讨论 |
| 10.3 论文创新点 |
| 10.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研、学术活动、发表论文情况 |
（6）马铃薯小G蛋白基因StRab5b的克隆及其调控晚疫病抗性的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 马铃薯晚疫病概述 |
| 1.1.1 马铃薯晚疫病的症状及危害 |
| 1.1.2 马铃薯晚疫病的防治 |
| 1.1.3 病原菌与寄主的互作 |
| 1.2 植物RAB蛋白的结构与功能 |
| 1.2.1 植物RAB蛋白的结构和特点 |
| 1.2.2 植物RAB蛋白的调控机制 |
| 1.2.3 植物RAB蛋白的功能 |
| 1.3 马铃薯晚疫病的抗性和信号通路 |
| 1.3.1 R基因主导的垂直抗性 |
| 1.3.2 QTL有关的水平抗性 |
| 1.3.3 马铃薯晚疫病相关的信号通路 |
| 1.4 马铃薯晚疫病抗性与植物体内ROS清除酶活性的关系 |
| 1.5 马铃薯晚疫病抗性相关基因功能的研究策略 |
| 1.5.1 利用基因沉默技术研究基因的功能 |
| 1.5.2 超表达研究基因的功能 |
| 1.6 马铃薯抗病育种现状 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 2 小G蛋白StRAB 5b的生物信息学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物物种的RAB蛋白序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 StRAB 5b蛋白功能的预测 |
| 2.2.2 StRAB 5b等RAB蛋白的系统进化树分析方法 |
| 2.2.3 StRAB 5b蛋白三级结构的预测 |
| 2.2.4 StRAB 5b的保守结构域分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 StRab5b和StRab的全基因序列分析 |
| 2.3.2 StRAB 5b蛋白功能的预测 |
| 2.3.3 StRAB 5b蛋白的三级结构 |
| 2.3.4 StRab 5b基因的系统进化树分析 |
| 2.3.5 StRAB 5b蛋白的保守结构域分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 StRab5b和StRab基因的克隆以及StRab5b基因表达谱和诱导表达研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 马铃薯品种 |
| 3.1.2 晚疫菌 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.1.5 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 马铃薯总RNA的提取方法 |
| 3.2.2 cDNA第一链的合成方法 |
| 3.2.3 RT-PCR扩增的体系和方法 |
| 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳的方法 |
| 3.2.5 StRab5b相对表达量以及诱导表达的检测 |
| 3.2.6 方差分析的方法 |
| 3.2.7 晚疫菌的培养、诱孢和接种 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 马铃薯总RNA的提取 |
| 3.3.2 StRab5b和StRab的基因克隆 |
| 3.3.3 晚疫菌的形态观察及诱孢后的显微观察 |
| 3.3.4 StRab5b基因的表达谱分析 |
| 3.3.5 StRab5b基因的诱导表达 |
| 3.4 讨论 |
| 4 StRab5b和StRab基因超表达载体和沉默表达载体的构建 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 载体和菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 仪器和设备 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 YEB和LB培养基的制备 |
| 4.2.2 克隆片段的胶回收 |
| 4.2.3 质粒提取的方法 |
| 4.2.4 RT-PCR和PCR扩增的体系和方法 |
| 4.2.5 目的基因片段与载体的连接 |
| 4.2.6 酶切反应体系 |
| 4.2.7 目的基因片段与超表达和沉默表达载体的连接 |
| 4.2.8 StRab5b和StRab基因超表达载体和沉默表达载体的构建策略 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 平末端载体与StRab5b和StRab重组质粒酶切鉴定 |
| 4.3.2 PLG片段与StRab5b和StRab的重组质粒的酶切鉴定 |
| 4.3.3 StRab5b和StRab超表达载体的构建 |
| 4.3.4 pBIA1300-StRab5b和StRab质粒转化农杆菌和PCR鉴定 |
| 4.3.5 pTRV2与VIGSStRab5b和StRab的质粒酶切鉴定 |
| 4.3.6 pTRV2-StRab5b和StRab的质粒的PCR鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 5 StRab5b的亚细胞定位和功能初步研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料和载体 |
| 5.1.2 马铃薯晚疫菌和培养基 |
| 5.1.3 试剂 |
| 5.1.4 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 亚细胞定位的方法 |
| 5.2.2 叶片中瞬时表达的方法 |
| 5.2.3 测定病斑的方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 StRab5b的亚细胞定位 |
| 5.3.2 StRab5b基因在烟草中的瞬时表达 |
| 5.3.3 StRab5b在马铃薯中的瞬时表达 |
| 5.4 讨论 |
| 6 StRab5b和StRab转基因植株的获得和调控马铃薯抗性的功能研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 菌液和试剂 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 引物 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 无菌苗的扩繁 |
| 6.2.2 农杆菌的扩繁 |
| 6.2.3 农杆菌侵染和共培养 |
| 6.2.4 芽的诱导分化 |
| 6.2.5 生根及抗性植株筛选 |
| 6.2.6 DAB染色液的配制和染色方法 |
| 6.2.7 台盼蓝染色液的配制和染色方法 |
| 6.2.8 壮苗和生薯培养基的配制 |
| 6.2.9 转基因植株实时定量PCR的鉴定 |
| 6.2.10 过氧化氢标准曲线的绘制和定量分析方法 |
| 6.2.11 SOD活性的测定 |
| 6.2.12 CAT活性的测定 |
| 6.2.13 POD活性的测定 |
| 6.2.14 APX活性的测定 |
| 6.2.15 抗性相关基因表达量的研究 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 马铃薯遗传转化体系的建立 |
| 6.3.2 马铃薯阳性转基因植株的PCR鉴定 |
| 6.3.3 马铃薯阳性植株中目标基因表达量的qRT-PCR鉴定 |
| 6.3.4 StRab5b和StRab转基因植株的表型鉴定 |
| 6.3.5 StRab5b和StRab转基因植株对P.infestans的抗性鉴定 |
| 6.3.6 StRab5b和StRab转基因植株接种后H_2O_2的积累 |
| 6.3.7 StRab5b和StRab转基因植株接种后坏死细胞数量检测 |
| 6.3.8 StRab5b和StRab转基因植株接种后SOD酶活性的变化 |
| 6.3.9 StRab5b和StRab转基因植株接种后POD酶活性的变化 |
| 6.3.10 StRab5b和StRab转基因植株接种后CAT酶活性的变化 |
| 6.3.11 StRab5b和StRab转基因植株接种后APX酶活性的变化 |
| 6.3.12 转基因植株接种后抗性相关基因ACS、LOX、NPR1转录水平的变化 |
| 6.4 讨论 |
| 7 烟草中沉默StRab5b、StRab同源基因及转基因植株的耐盐性评价 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 植物材料 |
| 7.1.2 菌液和试剂 |
| 7.1.3 仪器设备 |
| 7.1.4 引物 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 VIGS侵染液的配制 |
| 7.2.2 菌液的制备和叶片注射 |
| 7.2.3 测定病斑的方法 |
| 7.2.4 RNA提取、cDNA第一链合成、半定量RT-PCR和q-PCR反应体系 |
| 7.2.5 考马斯亮蓝染色液的配制和染色方法 |
| 7.2.6 沉默效率的计算方法 |
| 7.2.7 DNA的提取 |
| 7.2.8 不同盐浓度的设置和组培苗的处理 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 烟草VIGS沉默体系的建立 |
| 7.3.2 烟草中Pds、Rab5b和Rab基因的沉默效率 |
| 7.3.3 烟草中Rab5b和Rab基因沉默后对晚疫病的抗性鉴定 |
| 7.3.4 烟草中沉默Rab5b和Rab基因后病菌的定性以及定量测定 |
| 7.3.5 StRab5b和StRab转基因植株的耐盐性评价 |
| 7.4 讨论 |
| 8 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（7）马铃薯响应逆境信号的类受体激酶基因的筛选及功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 第一章 文献综述 |
| 1 马铃薯及病害研究 |
| 1.1 马铃薯简介 |
| 1.2 马铃薯病害 |
| 1.3 晚疫病危害及防控措施 |
| 1.4 干腐病危害及防控措施 |
| 2 植物防御机制研究 |
| 3 类受体激酶(Receptor like kinases,RLK)及植物免疫 |
| 3.1 RLK概述 |
| 3.1.1 RLK结构 |
| 3.1.2 RLK分类 |
| 3.1.3 RLK生物学功能 |
| 3.2 RLK及抗病研究 |
| 4 马铃薯的抗病研究 |
| 4.1 马铃薯抗病研究及糖苷生物碱(Steroidal glycoalkaloids,SGAs) |
| 4.1.1 SGAs的理化性质及来源 |
| 4.1.2 影响马铃薯中SGAs分布与含量变化的因素 |
| 4.1.3 马铃薯中SGAs的合成途径 |
| 4.1.4 SGAs与马铃薯抗性研究 |
| 4.2 RLKs与马铃薯抗性研究 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 马铃薯RLK鉴定及生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 马铃薯等多物种RLK鉴定方法 |
| 1.2 马铃薯RLK基因重复分析方法 |
| 1.3 马铃薯RLK响应生物逆境表达模式的数据提取及分析方法 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 马铃薯等9个物种RLK鉴定 |
| 2.2 马铃薯等9个物种RLK亚家族鉴定 |
| 2.3 马铃薯RLK基因重复分析 |
| 2.4 马铃薯RLK响应生物逆境的表达模式 |
| 3 讨论 |
| 第三章 马铃薯富含半胱氨酸的类受体激酶(CRK)鉴定及生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 数据搜索和CRK成员鉴定 |
| 1.2 马铃薯CRK基因的生物信息学分析 |
| 1.3 马铃薯CRK基因结构分析 |
| 1.4 马铃薯CRK基因启动子顺式作用元件(cis-element)分析 |
| 1.5 马铃薯干腐病和晚疫病菌接种方法 |
| 1.6 RNA提取及quantitative Real-time PCR(qRT-PCR) |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 马铃薯CRK基因鉴定 |
| 2.2 马铃薯、拟南芥等不同物种CRK家族进化分析 |
| 2.3 马铃薯CRK基因的染色体定位 |
| 2.4 马铃薯CRK的基因结构和蛋白功能结构域分析 |
| 2.5 马铃薯CRK基因家族顺式作用元件(cis-element)分析 |
| 2.6 CRKs在晚疫病菌侵染马铃薯叶片中的表达分析 |
| 2.7 CRKs在干腐病菌侵染马铃薯块茎中的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 马铃薯凝集素类受体激酶(Lec RLK)鉴定及生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 数据搜索和Lec RLK成员鉴定 |
| 1.2 马铃薯Lec RLK基因的生物信息学分析 |
| 1.3 马铃薯Lec RLK染色体位置和基因重复分析 |
| 1.4 马铃薯Lec RLK响应生物胁迫的表达模式分析 |
| 1.5 马铃薯Lec RLK响应真菌侵染的表达模式分析 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 马铃薯Lec RLK基因鉴定 |
| 2.2 马铃薯Lec RLK分类和结构域鉴定 |
| 2.3 马铃薯Lec RLK的染色体定位 |
| 2.4 马铃薯Lec RLK响应生物胁迫的表达分析 |
| 2.5 马铃薯Lec RLK响应干腐病和晚疫病病原菌的表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 马铃薯Lec RLK基因家族的进化和扩增分析 |
| 3.2 马铃薯Lec RLK基因重复 |
| 3.3 马铃薯G-型Lec RLK复杂结构域分析 |
| 3.4 马铃薯LecRLK对生物胁迫的响应 |
| 4 结论 |
| 第五章 光照诱导的马铃薯绿变过程中生物碱(SGA)合成基因和逆境胁迫基因的关系分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 RNA提取、c DNA文库构建及转录组测序 |
| 1.3 转录组数据分析与差异表达基因鉴定 |
| 1.4 顺式作用元件预测与基因共表达网络分析(WGCNA,Weighted gene co-expression network analysis) |
| 1.5 RNA-seq数据验证 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 光照处理后马铃薯块茎表皮的变化情况 |
| 2.2 转录组数据质量和差异表达基因分析 |
| 2.3 生物碱(SGA)合成相关基因的表达模式 |
| 2.4 Mapman对差异表达基因的功能分类分析 |
| 2.5 光照诱导下参与非生物胁迫的差异基因的变化分析 |
| 2.6 光照诱导下参与生物胁迫的差异基因的表达分析 |
| 2.7 SGA合成相关基因和抗病基因的顺式作用元件预测 |
| 2.8 qRT-PCR对差异基因表达分析的验证 |
| 2.9 SGA合成相关基因与抗病基因的共表达关系(WGCNA) |
| 2.10 RLKs在马铃薯块茎黑暗/光照条件下的差异表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第六章 马铃薯SD-2b基因的克隆与功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 RNA提取与检测 |
| 1.4 目的片段的扩增及质粒重组 |
| 1.4.1 目的片段的获得 |
| 1.4.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.4.3 T载体转化 |
| 1.4.4 质粒重组及其在大肠杆菌DH5α中的转化 |
| 1.4.4.1 提取质粒DNA |
| 1.4.4.2 质粒DNA的双酶切 |
| 1.4.4.3 表达载体的构建 |
| 1.4.5 农杆菌GV3101感受态细胞的制备 |
| 1.4.6 农杆菌GV3101转化 |
| 1.5 农杆菌渗入及晚疫病菌接种鉴定 |
| 1.5.1 农杆菌渗入和基因表达分析 |
| 1.5.2 晚疫病菌接种 |
| 1.6 亚细胞定位 |
| 1.7 数据处理与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 马铃薯SD-2b-1基因扩增 |
| 2.2 马铃薯SD-2b-1 基因与pFGC5941 质粒载体重组 |
| 2.3 农杆菌注射和马铃薯SD-2b-1基因表达分析 |
| 2.4 马铃薯叶片晚疫病发病情况检测 |
| 2.5 目标基因亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 第七章 全文结论和创新点 |
| 1 全文结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（8）烟草NtVQ35基因的鉴定及其抗青枯病基本功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 烟草青枯病研究概述 |
| 1.1.1 烟草青枯病的发现和分布 |
| 1.1.2 烟草青枯病菌的生物学特性 |
| 1.1.3 烟草青枯病的病状、危害和流行规律 |
| 1.1.4 青枯病菌的致病机理 |
| 1.1.5 烟草青枯病的防控 |
| 1.2 VQ蛋白在植物抗病中的研究进展 |
| 1.2.1 VQ蛋白的发现、特征及进化分布 |
| 1.2.2 vq基因特征 |
| 1.2.3 VQ蛋白的生物学功能 |
| 1.2.4 VQ蛋白的作用机制 |
| 1.2.5 VQs保守基序的重要性 |
| 1.3 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术在植物抗病研究中的应用 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas系统的发现 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas系统的组成与作用机制 |
| 1.3.3 gRNA CRISPR-Cas9 靶位点选择优势 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9 在植物抗病研究中的应用 |
| 第二章 前言 |
| 第三章 烟草vq基因家族的鉴定、生物信息学分析及其在不同处理下的应答 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 序列的获取和鉴定 |
| 3.2.2 NtVQ基因家族成员的命名 |
| 3.2.3 NtVQ蛋白序列分析 |
| 3.2.4 NtVQ基因结构分析 |
| 3.2.5 NtVQ启动子序列分析 |
| 3.2.6 系统进化树构建 |
| 3.2.7 烟草材料的处理 |
| 3.2.8 青枯病原菌的接种方法 |
| 3.2.9 烟草RNA提取 |
| 3.2.10 烟草cDNA的合成与检测 |
| 3.2.11 实时荧光定量PCR及数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 烟草VQ蛋白鉴定、命名以及序列分析 |
| 3.3.2 系统进化树的构建与分析 |
| 3.3.3 烟草vq基因成员基因结构 |
| 3.3.4 烟草vq基因在激素处理下的应答情况 |
| 3.3.5 不同非生物胁迫下烟草vq基因的表达 |
| 3.3.6 烟草vq基因在响应病原菌胁迫时的表达 |
| 3.3.7 NtVQ基因家族顺式元件分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 烟草中VQ蛋白生信分析 |
| 3.4.2 NtVQ基因在不同处理时的表达情况 |
| 第四章 NtVQ35基因抗青枯病基本功能分析 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 烟草NtVQ35编辑植株的获得 |
| 4.2.2 NtVQ35过表达植株的构建与获得 |
| 4.2.3 带NtVQ35启动子表达载体植株的构建 |
| 4.2.4 青枯病菌接种方法 |
| 4.2.5 烟株接种青枯病菌后病菌数目统计方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 烟草NtVQ35编辑植株的获得 |
| 4.3.2 NtVQ35过表达植株的获得 |
| 4.3.3 NtVQ35启动子植株的获得 |
| 4.3.4 编辑植株、过表达植株、野生型烟草接种青枯病菌 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 NtVQ35 编辑植株、过表达与野生型响应Rsc侵染的转录组学研究及植株内水杨酸的测定 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 测序样品准备 |
| 5.1.2 烟草叶片总RNA提取及质量检测 |
| 5.1.3 转录组测序 |
| 5.1.4 文库构建与测序 |
| 5.1.5 数据分析 |
| 5.1.6 qRT-PCR验证 |
| 5.1.7 水杨酸测定方法及样品准备 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 总RNA质量检测 |
| 5.2.2 测序数据过滤 |
| 5.2.3 参考基因组比对结果 |
| 5.2.4 差异表达基因的筛选 |
| 5.2.5 差异表达基因表达趋势分析 |
| 5.2.6 DGEs GO功能分类富集分析 |
| 5.2.7 趋势表达基因KEGG通路富集分析 |
| 5.2.8 与植物抗病性相关代谢途径的筛选及基因分析 |
| 5.2.9 qRT-PCR验证RNA-seq数据 |
| 5.2.10 植株体内水杨酸的测定 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 主要结论、创新点及研究展望 |
| 1 主要结论 |
| 1.1 探明烟草vq基因家族可分为I-VIII组,探索了几种处理的应答情况 |
| 1.2 初步明确vq家族代表基因NtVQ35 负向调控烟草青枯病菌的侵染 |
| 1.3 探索了NtVQ35 对青枯病菌负向调控作用可能与SA信号转导有关 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文及参加科研项目 |
（9）小豆-锈菌（Uromyces vignae）互作的转录组分析及差异表达基因鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 小豆及小豆锈病 |
| 1.2 植物抗病基因的作用机制 |
| 1.2.1 细胞表面直接感知病原物激发植物免疫 |
| 1.2.2 间接识别病原菌胞外效应蛋白激活抗性反应 |
| 1.2.3 NLRs直接识别胞内效应蛋白激活免疫反应 |
| 1.2.4 抗病基因的间接互作机制—“诱饵”模式和“守卫”模式 |
| 1.3 基因表达分析在寄主-病原互作关键基因鉴定中的应用 |
| 1.3.1 寄主-病原真菌互作关键基因鉴定 |
| 1.3.2 寄主-病原细菌互作关键基因鉴定 |
| 1.3.3 RNA-Seq技术在寄主-病原互作研究中的应用 |
| 1.4 基于实时定量PCR(qRT-PCR)技术的基因表达分析 |
| 1.4.1 qRT-PCR技术面临的问题 |
| 1.4.2 qRT-PCR需要适宜的内参基因 |
| 1.4.3 内参基因选择与应用中存在的问题 |
| 1.4.4 内参基因GAPDH |
| 1.4.5 内参基因核糖体亚基18S rRNA |
| 1.4.6 不同因素下内参基因表达水平的变异 |
| 1.4.7 验证内参基因 |
| 1.5 基于瞬时表达技术的基因功能验证 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试小豆品种及豇豆单胞锈菌分离株 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂(试剂盒)及其它材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 小豆抗性品种响应锈菌侵染的转录组分析 |
| 2.2.2 适于实时定量PCR分析的小豆内参基因筛选与验证 |
| 2.2.3 小豆抗锈病相关基因的筛选及表达模式分析 |
| 2.2.4 小豆抗病相关基因Va EG45 的功能分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小豆抗性品种响应锈菌侵染的转录组分析 |
| 3.1.1 测序样品总RNA质控 |
| 3.1.2 测序数据质控及基因组mapping |
| 3.1.3 差异表达基因分析及qRT-PCR验证 |
| 3.1.4 差异表达基因GO和 KEGG富集分析 |
| 3.1.5 差异表达的小豆防卫反应相关基因 |
| 3.1.6 小豆差异表达的植物激素信号及转录因子 |
| 3.1.7 差异表达基因的时间序列分析 |
| 3.1.8 结论与讨论 |
| 3.2 适于实时定量PCR分析的小豆内参基因筛选与验证 |
| 3.2.1 引物特异性及扩增效率检测 |
| 3.2.2 候选内参基因表达稳定性分析 |
| 3.2.3 候选内参基因表达稳定性的综合评判 |
| 3.2.4 qRT-PCR验证候选内参的稳定性 |
| 3.2.5 结论与讨论 |
| 3.3 小豆抗锈病相关基因在病菌侵染过程中的表达模式分析 |
| 3.3.1 候选抗病相关基因筛选 |
| 3.3.2 Va EG45及Va NATA1 基因应答锈菌侵染的表达模式分析 |
| 3.3.3 结论与讨论 |
| 3.4 小豆Va EG45 基因的功能分析 |
| 3.4.1 Va EG45 基因编码区全长克隆、序列特征分析及顺式作用元件分析 |
| 3.4.2 Va EG45 的瞬时表达及亚细胞定位 |
| 3.4.3 Va EG45 瞬时表达对烟草抗灰霉菌侵染的影响 |
| 3.4.4 Va EG45 参与烟草抗病机理的初步研究 |
| 3.4.5 结论与讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）高抗水稻白叶枯病相关新基因的克隆及抗病机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 水稻抗白叶枯病研究进展 |
| 1.1 水稻白叶枯病 |
| 1.1.1 水稻白叶枯病概述 |
| 1.1.2 水稻抗白叶枯病基因的挖掘和功能研究 |
| 1.2 细胞程序性死亡和类病变突变体 |
| 1.2.1 细胞程序性死亡 |
| 1.2.2 水稻类病变突变体及其在水稻抗病性中的研究 |
| 1.3 疣粒野生稻对白叶枯病的抗性研究及利用 |
| 1.4 Rubisco活化酶的研究进展 |
| 1.5 病程相关蛋白 |
| 1.6 蛋白质组学及其在水稻抗病研究中的应用 |
| 1.7 酵母双杂交及其在水稻抗病研究中的应用 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 hpil3 目标基因的定位、克隆和转基因功能互补验证 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 CTAB法大量提取水稻基因组DNA |
| 2.2.2 候选基因的克隆和表达载体的构建 |
| 2.2.3 转基因水稻植株的鉴定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 hpil3 的表型及抗性鉴定 |
| 2.3.2 hpil3 目标基因的定位和候选目标基因的筛选 |
| 2.3.3 hpil3 候选目标基因的克隆和超表达载体的构建 |
| 2.3.4 hpil3 目标基因超表达植株的转化 |
| 2.3.5 hpil3 转基因植株的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 HPIL3 和抗病相关基因的表达及蛋白组学分析 |
| 3.1 试验材料与试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 接种白叶枯病菌后不同时间目标基因的表达量变化 |
| 3.2.2 hpil3和DLX病程相关基因的表达 |
| 3.2.3 水稻叶片总蛋白的提取 |
| 3.2.4 总蛋白的裂解 |
| 3.2.5 总蛋白的纯化 |
| 3.2.6 总蛋白的定量 |
| 3.2.7 荧光标记 |
| 3.2.8 荧光差异双向凝胶电泳 |
| 3.2.9 凝胶扫描和图像分析 |
| 3.2.10 考马斯亮蓝凝胶制备 |
| 3.2.11 差异表达蛋白质谱鉴定 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 RT-qPCR分析HPIL3的表达 |
| 3.3.2 RT-qPCR分析病程相关蛋白表达 |
| 3.3.3 hpil3 的蛋白组学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 HPIL3 的互作基因筛选 |
| 4.1 试验材料与试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 Trizol法提取样品RNA并检测 |
| 4.2.2 cDNA的 frist strand合成 |
| 4.2.3 LD-PCR合成ds-cDNA |
| 4.2.4 构建诱饵载体和猎物载体 |
| 4.2.5 试剂盒和碱法大量抽提质粒 |
| 4.2.6 酵母感受态细胞的制备 |
| 4.2.7 酵母自激活 |
| 4.2.8 ds cDNA和 Sma? 酶切后的PGADT7-Rec共转酵母感受态细胞 |
| 4.2.9 酵母质粒的提取 |
| 4.2.10 互作基因的酵母双杂验证 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 HPIL3 的克隆和筛库相关载体构建 |
| 4.3.2 酵母双杂交的建库 |
| 4.3.3 HPIL3 的自激活检测 |
| 4.3.4 酵母双杂筛库结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 疣粒野生稻对白叶枯病的抗性机制研究 |
| 5.1 试验材料与试剂 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 疣粒野生稻对Xoo的抗性鉴定 |
| 5.2.2 叶绿体的提取和分离 |
| 5.2.3 SDS-PAGE和免疫分析 |
| 5.2.4 叶片提取物中H_2O_2 含量的测定 |
| 5.2.5 H_2O_2 的亚细胞定位 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 疣粒野生稻对Xoo的抗性鉴定 |
| 5.3.2 H_2O_2 含量测定、亚细胞定位及其对RCA的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、mRNADD-PCR技术及其在植物抗病基因研究中的应用（论文参考文献）
- [1]假茄科雷尔氏菌对瓜类作物的致病性以及南瓜响应病菌侵染的转录组和代谢组分析[D]. 何永林. 广西大学, 2021(12)
- [2]红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化[D]. 蒲小剑. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [3]尖孢镰刀菌SIX效应基因进化关系及其在侵染紫花苜蓿过程中的作用[D]. 滕倩. 兰州大学, 2021(09)
- [4]真菌胁迫响应TaNAC基因和小麦杂种衰亡分子机理研究[D]. 吕士凯. 西北农林科技大学, 2021
- [5]宿根矮化病菌侵染甘蔗的生理与分子机制研究[D]. 祝开. 广西大学, 2020
- [6]马铃薯小G蛋白基因StRab5b的克隆及其调控晚疫病抗性的功能研究[D]. 田再民. 内蒙古农业大学, 2020(06)
- [7]马铃薯响应逆境信号的类受体激酶基因的筛选及功能验证[D]. 张卫娜. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [8]烟草NtVQ35基因的鉴定及其抗青枯病基本功能研究[D]. 刘翠花. 西南大学, 2020(01)
- [9]小豆-锈菌（Uromyces vignae）互作的转录组分析及差异表达基因鉴定[D]. 迟超. 黑龙江八一农垦大学, 2019(02)
- [10]高抗水稻白叶枯病相关新基因的克隆及抗病机制研究[D]. 梅琼. 沈阳农业大学, 2019(08)
标签：基因合成论文;