禾谷镰刀菌ABC蛋白调控铁动态平衡和致病机制的研究

论文摘要

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter,ABC transporter）是生物体保守的一类蛋白大家族。ABC蛋白利用ATP水解产生的能量主动运输各种物质,进而参与重金属解毒、脂质代谢、信号传导、多药抗性、核糖体生物合成和mRNA转运等多种生命活动。目前,真菌中已有ABC蛋白的研究主要集中在多药抗性方面,在铁动态平衡和致病中功能研究鲜有报道。由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起的小麦赤霉病是小麦生产上的主要病害之一,不仅造成严重产量损失,病菌产生的真菌毒素严重威胁着粮食安全和人类健康。本研究通过生物信息学,遗传学和生物化学的实验方法,研究了禾谷镰刀菌ABC蛋白在铁动态平衡和致病中的功能,结果发现:1、大多数真菌含有30-45个ABC蛋白,而禾谷镰刀菌基因组中有62个ABC蛋白。根据蛋白结构域将这62个ABC蛋白分为9个亚家族（ABC-A-G,ABC-I和YDR061W-like）。通过同源同组手段对62个ABC基因进行敲除,获得了 60个ABC基因敲除突变体。但经过3次独立试验未获得2个ABC蛋白基因（FGSG04181和FGSG07101）的敲除突变体,初步表明这两个基因是病菌生长必需的基因。测定60个ABC敲除突变体对高铁敏感性发现,FgATM1的敲除突变体对高铁极度敏感且胞内有大量铁的积累;测定60个ABC敲除突变体致病性发现,一个不含跨膜结构域的ABC蛋白（FgArb1）突变体完全丧失致病性。2、研究FgAtm1调控铁动态平衡的机制发现:（1）敲除FgATM1导致细胞质铁硫蛋白亚硝酸还原酶FgNiiA和黄嘌呤脱氢酶FgXdh的酶活下降;（2）FgNiiA和FgXdh的酶活下降能够激活氮源转录因子FgAreA基因高水平转录;（3）FgAreA蛋白能直接结合另一个转录因子FgHapX的启动子区,正向调控其转录;（4）FgHapX是一个转录抑制子,直接抑制铁利用相关基因的表达;此外,FgHapX又能通过转录抑制FgSreA（另一个转录抑制子）的表达,进而激活铁吸收基因的表达;（5）FgHapX对其靶相关基因的调控依赖于激酶FgYak1介导的磷酸化修饰及其互作蛋白——单谷氧还蛋白FgGrx4。这些结果表明,ABC蛋白FgAtm1通过转录因子级联FgAreA-HapX调控禾谷镰刀菌胞内铁动态平衡。3、研究FgArb]调控致病性的分子机制发现:（1）FgArb1与MAPK蛋白激酶FgSte7互作调控下游激酶FgGpmk1的磷酸化进而调控病菌侵染结构形成;（2）FgArb1通过调控病菌对氧化和细胞壁胁迫的响应、DON毒素的合成,从而调控病菌在寄主组织中的侵染生长;（3）FgArb1在病菌无性和有性生殖中发挥重要作用;（4）FgArb1通过参与核糖体小亚基的细胞核输出,进而发挥其生物学功能;（5）FgArb1上K28,K65,K341和K525位点的乙酰化修饰对于FgArb1的生物学功能至关重要。本研究表明乙酰化的FgArb1通过调控病菌侵染结构形成和寄主中的侵染性生长,共同调控了禾谷镰刀菌的致病性。上述研究结果有助于我们深入理解真核生物中ABC蛋白功能,也为小麦赤霉病关键防控技术的研发提供理论基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
•   1 小麦赤霉病研究概况
•     1.1 小麦赤霉病概述
•     1.2 赤霉病原菌生物学特征
•     1.3 赤霉病原菌侵染循环
•     1.4 小麦赤霉菌病害治理
•       1.4.1 抗病品种选育
•       1.4.2 农业措施
•       1.4.3 杀菌剂
•       1.4.3 生物防治
•   2 ATP-binding cassette （ABC）转运蛋白研究概述
•     2.1 ABC转运蛋白概述
•     2.2 ABC转运蛋白分类
•     2.3 ABC转运蛋白的功能
•       2.3.1 ABC-A亚家族
•       2.3.2 ABC-B（MDR）亚家族
•       2.3.3 ABC-C（MRP/CFTR）亚家族
•       2.3.4 ABC-D（ALDP）亚家族
•       2.3.5 ABC-E和ABC-F（YEF3/RLI）亚家族
•       2.3.6 ABC-G （PDR）亚家族
•       2.3.7 ABC-I（Caf16-like）和YDR061 W-like亚家族
•     2.4 ABC蛋白在真菌调控铁动态平衡的研究进展
•       2.4.1 铁动态平衡调控的重要性
•       2.4.2 ABC蛋白Atm1对铁动态平衡的调控
•       2.4.3 铁动态平衡的转录后和翻译后调控
•       2.4.4 其他丝状真菌铁动态平衡调控
•     2.5 ABC蛋白在真菌致病中的研究进展
•   3 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
•   1 实验材料
•     1.1 菌株与载体
•     1.2 植物材料
•   2 实验方法
•     2.1 禾谷镰刀菌的培养和保存方法
•     2.2 禾谷镰刀菌基因组DNA的小量提取
•     2.3 禾谷镰刀菌基因组DNA的大量制备（CTAB法）
•     2.4 PCR技术
•     2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳
•     2.6 PCR产物的纯化
•     2.7 基因克隆技术
•     2.8 禾谷镰刀菌基因敲除载体的构建
•     2.9 禾谷镰刀菌融合标签的基因回补载体的构建
•     2.10 PEG介导的禾谷镰刀菌原生质体转化
•     2.11 禾谷镶刀菌转化子的验证
•     2.12 Southen blot杂交
•     2.13 总RNA的提取、cDNA的合成和基因的表达量分析
•     2.14 Western blot分析
•     2.15 免疫共沉淀（Co-IP）实验
•     2.16 双分子荧光互补（BIFC）实验
•     2.17 禾谷镰刀菌表型测定
•     2.18 禾谷镰刀菌致病性测定
•     2.19 DON毒素测定
•     2.20 铁含量和噬铁素含量测定
•     2.21 酶活测定
•     2.23 活性氧含量测定
•     2.24 酵母双杂交实验
•     2.25 染色质免疫共沉淀（ChIP-PCR）实验
•     2.26 Phos-tag检测实验
•     2.27 EMSA（电泳迁移率变动分析）实验
• 第三章 结果与分析
•   1 禾谷镰刀菌中ABC转运蛋白FgAtm1调控铁动态平衡机制的研究
•     1.1 禾谷镰刀菌中ABC转运蛋白的鉴定与敲除
•     1.2 FgAtm1参与铁动态平衡的调控过程
•       1.2.1 参与铁动态平衡的ABC蛋白的筛选
•       1.2.2 FgAtm1的鉴定
•     1.3 FgAtm1调控铁在线粒体和胞内的含量
•     1.4 FgAtm1调控细胞质铁硫蛋白的活性
•       1.4.1 FgATM1的缺失导致细胞质而非线粒体中的铁硫蛋白活性的下降
•       1.4.2 △FgAtm1的生长缺陷能被细胞质铁硫蛋白部分回补
•       1.4.3 FgAtm1调控细胞内总谷胱甘肽的含量
•     1.5 FgATM1的敲除激活转录因子级联FgAreA-HapX
•       1.5.1 细胞质铁硫蛋白亚硝酸还原酶和黄嘌呤脱氢酶参与铁动态平衡
•       1.5.2 FgNiiA和FgXdh的失活负反馈激活转录因子FgAreA
•       1.5.3 氮源转录因子FgAreA转录激活铁的转录抑制子FgHapX
•     1.6 FgHapX直接转录抑制铁利用相关基因而通过对另一个转录因子FgSreA的抑制来间接激活铁吸收基因
•       1.6.1 FgHapX转录调控铁相关基因的表达
•       1.6.2 FgHAPX的敲除缓解△FgAtm1敲除突变体的生长缺陷和铁的过量积累
•       1.6.3 FgHapX直接抑制铁利用基因的转录
•       1.6.4 FgHapX间接激活铁吸收基因的转录通过抑制转录抑制子FgSreA
•       1.6.5 FgSreA转录抑制铁吸收基因的表达并参与铁动态平衡的调控
•     1.7 FgHapX与FgGrx4互作调控铁的动态平衡
•       1.7.1 FgHapX与FgGrx4在细胞核中互作
•       1.7.2 FgGrx4协助FgHapX调控FgHapX的转录活性
•     1.8 丝苏氨酸激酶FgYaK1对FgHapX的磷酸化调控其转录活性
•       1.8.1 FgHapX在S245和S338发生磷酸化修饰
•       1.8.2 FgHapX的磷酸化修饰参与铁动态平衡调控
•       1.8.3 筛选介导FgHapX的磷酸化修饰的激酶——FgYak1
•       1.8.4 激酶FgYak1与FgHapX互作调控其转录活性
•     1.9 小结与讨论
•   2 禾谷镰刀菌中ABC蛋白FgArb1调控致病机制的研究
•     2.1 FgArb1参与禾谷镰刀菌的致病机制研究
•       2.1.1 FgArb1参与禾谷镰刀菌致病过程
•       2.1.2 FgArb1参与禾谷镰刀菌穿透过程
•       2.1.3 FgArb1与MAPK激酶FgSte7互作调控其下游激酶FgGpmk1的磷酸化
•       2.1.4 FgArb1影响ATP刺激的FgGpmk1的磷酸化
•     2.2 FgArb1参与致病机制的功能研究
•       2.2.1 FgArb1参与在划伤寄主植物内的侵染性生长
•       2.2.2 FgArb1响应氧化压力
•       2.2.3 FgArb1调控ROS清除的相关酶的蛋白量
•       2.2.4 FgArb1响应细胞壁压力
•       2.2.5 FgArb1参与细胞壁完整性调控
•       2.2.6 FgArb1调控毒素生物合成
•     2.3 FgArb1调控禾谷镰刀菌无性和有性生殖
•       2.3.1 FgArb1对于禾谷镰刀菌无性生殖的重要性
•       2.3.2 FgArb1对于禾谷镰刀菌有性生殖的重要性
•     2.4 FgArb1调控小核糖体亚基的细胞核输出
•       2.4.1 FgArb1与核糖体相关蛋白FgRli1互作
•       2.4.2 FgArb1小核糖体亚基的细胞核输出
•       4.4.3 FgArb1参与禾谷镰刀菌总蛋白的生物合成
•     2.5 FgArb1的乙酰化修饰对其功能的重要性分析
•       2.5.1 FgArb1存在4个乙酰化修饰位点
•       2.5.2 FgArb1乙酰化修饰对其生长,无性繁殖和致病功能的重要性
•       2.5.3 FgArb1乙酰化修饰调控FgArb1对MAPK激酶FgGpmk1的磷酸化
•     2.6 小结与讨论
• 第四章 全文结论与后续工作展望
•   1 全文结论
•   2 后续工作展望
• 参考文献
• 附录: 引物序列

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王芝慧

导师: 马忠华,尹燕妮

关键词: 禾谷镰刀菌,蛋白,铁动态平衡,细胞质铁硫蛋白的装配,致病,穿透,蛋白合成,乙酰化

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 浙江大学

分类号: S432.44

总页数: 220

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