CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用

论文摘要

CRISPR/Cas9是一种新型的基因组定向编辑技术,近年来在烟草基因组的定向编辑中得到了广泛应用。CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在许多物种中表现出很大的潜力,为了探索CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑的技术体系,本文针对烟草PCS1、HMA2、e IF4E、TOM3、TOM1 5个不同性状相关的基因构建了多靶点敲除的CRISPR/Cas9系统,并借助农杆菌介导的遗传转化技术转化烟草品种K326。对阳性植株的筛选、靶位点基因组的PCR扩增与测序分析表明,构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功转化到烟草中,能够同时靶向突变5个基因。5个基因同时突变的检出率为53.8%,单基因的突变检出率在76.9%与92.3%之间。进一步的脱靶检测分析显示,在所预测脱靶的候选位点上均未发生脱靶现象。本文构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统可将多个基因进行有效突变,为烟草基因功能研究和基于CRISPR/Cas9技术的多性状改良奠定了基础。

论文目录

• 1 材料与方法：
•   1.1 材料
•   1.2 方法
•     1.2.1 sgRNA设计及载体构建
•     1.2.2 烟草PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2基因敲除靶位点的cDNA克隆
•     1.2.3 敲除载体转化农杆菌及烟草遗传转化
•     1.2.4 遗传转化株的获得及突变位点检测
•     1.2.4 脱靶分析
• 2 结果与分析
•   2.1 多基因敲除靶位点的sgRNA设计
•   2.2 烟草PCS1、e IF4E、TOM3、TOM1和HMA2基因的sgRNA区域验证
•   2.3 CRISPR/Cas9介导多基因敲除的sgRNA设计与构建
•   2.4 T0代遗传转化植株的检测
•   2.5 烟草PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2突变靶位点的扩增与突变分析
•   2.6 脱靶位点预测与检测分析
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 谢小东,高军平,李泽锋,张剑锋,魏攀,罗朝鹏,王晨,武明珠,翟妞,杨军

关键词: 烟草,多基因,突变

来源: 中国烟草学报 2019年04期

年度: 2019

分类: 农业科技,工程科技Ⅰ辑,基础科学

专业: 生物学,农作物

单位: 中国烟草总公司郑州烟草研究院国家烟草基因研究中心,湖南中烟工业有限责任公司技术研发中心

基金: 郑州烟草研究院院长科技发展基金项目“烟草多基因CRISPRCas9编辑体系构建及应用研究”(902017CA0210),国家烟草专卖局资助项目“烟草基因功能元件全景图构建及关键基因挖掘与调控节点研究”(110201601033(JY-07))

分类号: S572;Q943.2

DOI: 10.16472/j.chinatobacco.2019.065

页码: 72-80

总页数: 9

文件大小: 1429K

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