基于转瓶生物反应器制备细胞聚团应用于软骨组织再生的研究

论文摘要

基于细胞的软骨组织损伤再生策略中重要要素之一就是细胞,如何获得大量软骨表型的细胞是当前的重要研究内容。细胞聚团培养不仅能够模拟细胞的体内微环境,从而更好的维持细胞功能,也可被直接应用于基于细胞的治疗策略。本文基于转瓶生物反应器,考察了软骨细胞和间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）这两种有望应用于软骨组织再生的主要细胞种类的聚团动力学和机制。利用转瓶建立了牛软骨细胞（Bovine articular chondrocyte,bACs）、兔间充质干细胞（Rabbit mesenchymal stem cells,rMSCs）以及此两种细胞混合的聚团培养体系,考察了转瓶搅拌转速和细胞接种密度对细胞成团动力学、聚团尺寸、细胞增殖和胞外基质（Extracellular matrix,ECM）分泌的影响,探讨了细胞聚团的分子机制,并探究了细胞聚团培养对软骨细胞表型和MSCs干性的影响,获得以下主要发现:（1）转瓶分别单独培养bACs和rMSCs形成聚团,转瓶搅拌转速和细胞接种密度都能影响bACs和rMSCs的成团速率及聚团尺寸。在一定范围内,转速越低,细胞成团速率越快,细胞聚团平均尺寸越大;细胞接种密度越高,细胞成团速率越快,细胞聚团平均尺寸越大。培养时间越长,细胞聚团平均尺寸越大。（2）qRT-PCR分析细胞粘附分子和ECM分子的基因表达水平来考察细胞成团的分子机制,结果发现,β1整合素介导的细胞与ECM的相互作用可能参与了bACs聚团形成过程;而钙黏蛋白（Cadherin）介导的细胞与细胞的相互作用可能参与了rMSCs聚团形成过程。（3）基因表达的定量分析发现,转瓶培养bACs形成聚团维持并且改善了软骨分化,Π型胶原和SOX-9的基因表达水平增加,而Aggrecan的基因表达水平得以维持。转瓶培养rMSCs形成聚团提高了干细胞的干性,表现为SOX-2,NANOG,OCT-4干性标志的基因的表达水平都有显著性的提高。（4）转瓶混合培养bACs和rMSCs,也能够形成细胞聚团,而且在这些细胞聚团中,rMSCs主要集中在聚团内核,bACs则分布于聚团外周。综上所述,本文通过建立基于转瓶的培养体系,制备了具有软骨分化潜能的细胞聚团,揭示了培养条件对细胞聚团形成过程的影响规律并初步认识了其分子机制,为后续将细胞聚团大规模应用于软骨组织再生研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 关节软骨组织
•     1.1.1 关节软骨组织的组成、结构和功能
•     1.1.2 关节软骨组织损伤及临床治疗
•   1.2 基于细胞的软骨再生修复策略
•     1.2.1 自体软骨细胞移植技术
•     1.2.2 软骨组织工程
•   1.3 3D细胞聚团应用于软骨组织再生
•     1.3.1 体外细胞培养方式
•       1.3.1.1 2D细胞培养
•       1.3.1.2 3D细胞培养
•     1.3.2 细胞聚团的基本概念
•     1.3.3 细胞聚团的制备方法
•       1.3.3.1 静态培养制备聚团
•       1.3.3.2 生物反应器动态培养制备细胞聚团
•     1.3.4 细胞聚团形成的分子机理
•     1.3.5 细胞聚团应用于软骨组织再生
•       1.3.5.1 软骨细胞聚团
•       1.3.5.2 MSCs聚团
•       1.3.5.3 软骨细胞和MSCs混合聚团
•   1.4 课题的提出
• 第2章 材料与方法
•   2.1 主要实验试剂
•   2.2 主要实验仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 bACs分离和培养
•     2.3.2 rMSCs分离和培养
•     2.3.3 细胞冻存和复苏
•     2.3.4 细胞传代培养和细胞标记
•     2.3.5 转瓶培养
•     2.3.6 DNA和GAG的定量分析
•     2.3.7 MTT测定
•     2.3.8 死活染色
•     2.3.9 SEM
•     2.3.10 明场拍照及图象分析
•     2.3.11 PCR
•     2.3.12 统计学分析
• 第3章 实验结果与讨论
•   3.1 转瓶生物反应器培养bACs形成聚团
•     3.1.1 转瓶生物反应器的搅拌转速对bACs成团的影响
•       3.1.1.1 搅拌转速对bACs成团速率的影响
•       3.1.1.2 细胞聚团形态分析
•       3.1.1.3 搅拌转速对bACs聚团尺寸和圆度的影响
•       3.1.1.4 死活染色
•       3.1.1.5 搅拌转速对bACs增殖和GAG分泌的影响
•     3.1.2 细胞接种密度对bACs成团的影响
•       3.1.2.1 细胞接种密度对bACs成团速率的影响
•       3.1.2.2 细胞聚团形态分析
•       3.1.2.3 细胞接种密度对bACs聚团尺寸和圆度的影响
•       3.1.2.4 细胞接种密度对bACs增殖和GAG分泌的影响
•     3.1.3 基因分析
•   3.2 转瓶生物反应器培养rMSCs形成聚团
•     3.2.1 转瓶生物反应器的搅拌转速对rMSCs成团的影响
•       3.2.1.1 搅拌转速对rMSCs成团速率的影响
•       3.2.1.2 细胞聚团形态分析
•       3.2.1.3 搅拌转速对rMSCs聚团尺寸和圆度的影响
•       3.2.1.4 搅拌转速对rMSCs增殖的影响
•     3.2.2 细胞接种密度对rMSCs成团的影响
•       3.2.2.1 细胞接种密度对rMSCs成团速率的影响
•       3.2.2.2 细胞聚团形态分析
•       3.2.2.3 细胞接种密度对rMSCs聚团尺寸和圆度的影响
•       3.2.2.4 死活染色
•       3.2.2.5 细胞接种密度对rMSCs增殖的影响
•     3.2.3 基因分析
•   3.3 转瓶混合培养bACs和rMSCs形成细胞聚团
•     3.3.1 bACs和rMSCs在转瓶中形成聚团
•     3.3.2 细胞聚团表面形态和内部分布
•     3.3.3 细胞聚团尺寸和圆度
•     3.3.4 细胞增殖及GAG分泌
•   3.4 本章小结
• 第4章 全文总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附：攻读硕士期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 何惠敏

导师: 叶朝阳

关键词: 软骨细胞,间充质干细胞,转瓶,细胞聚团,聚团动力学

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,生物医学工程

单位: 华东理工大学

分类号: R318

总页数: 68

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