牛源A型多杀性巴氏杆菌菌苗候选株的筛选及免疫效果的初步评价

论文摘要

目的:本研究以在新疆北疆部分地区分离得到的9株牛源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）为研究对象,在确定新疆北疆部分地区疑似病例中分离的Pm流行的血清型及ST型的基础上,筛选出1-2株毒性强、免疫原性好、疫苗保护率高的牛源A型Pm菌苗候选株,用于后期Pm菌苗的研究。方法:（1）采集病料按照常规方法分离培养细菌,对分离菌株进行生化鉴定、16S rRNA及Pm特异性鉴定基因Kmt的PCR鉴定,采用荚膜、脂多糖多重PCR及MLST分型方法对Pm分离株进行分型,初步确定从新疆北疆部分地区疑似病例中分离的Pm主要血清型及ST型。（2）采用PCR方法检测9株牛源Pm分离株的7类25个毒力基因、12类22个耐药基因的分布情况;采用纸片扩散法（K-B法）对9株牛源Pm分离株进行20种药物的敏感性测定;以相同剂量人工感染小鼠筛选强毒株并采用寇氏法测定强毒分离株小鼠半数致死量(LD50);制作病理切片观察被Pm感染死亡小鼠肺脏、肝脏、脾脏的病理学变化。（3）将筛选出的4株Pm分别增菌培养,浓缩至所需要的浓度,0.4%甲醛灭活10h后乳化制备成灭活菌苗;采用间接ELISA方法检测菌苗免疫小鼠后连续5周内产生的抗体水平;采用免疫攻毒保护试验测定4组Pm菌苗对小鼠的免疫保护率;感染死亡小鼠脏器病原菌的分离鉴定及特异性基因的PCR检测。结果:（1）经生化鉴定及PCR鉴定分离得到9株Pm（命名为Pm8、Pm9、Pm12、Pm13、Pm14、Pm17、Pm18、Pm122,PmM6）,其中8株Pm的荚膜型:脂多糖型:MLST型均为A:L3:ST1型;另1株Pm的荚膜型:脂多糖型:MLST型为B:L2:ST44型。（2）9株Pm分离株的17个毒力基因（exbB,exbD,fimA,fur,hgbA,hsf2,nanB,ompH,ptfA,oma87,ompA,plpB,tonB,psl,sodA,sodC,tbpA）检出率高达100%,toxA的检出率为0%;9株Pm全部检出β-内酰胺类blaTEM基因,部分菌株检出strA,sul2,strB耐药基因;分离株均显示不同程度的致病性,4株毒力较强的菌株对小鼠LD50值分别为Pm8菌株为100.614.614 CFU,Pm12菌株为100.629CFU,Pm13菌株为100.547CFU,Pm122菌株为100.505CFU。（3）抗体水平检测结果:4株Pm菌苗在首次免疫小鼠后的第一周、第二周抗体水平缓慢上升,这两周抗体水平较低,抗体效价多为1:80,二免后的一周血清效价到达较高水平,效价为1:3201:640,其中Pm8,Pm12在二免后的一周血清抗体效价较高,达到1:640。免疫攻毒保护试验结果:在Pm攻毒后的14d菌苗对小鼠保护率分别为Pm12为80%,Pm122为56%,Pm8为66%,Pm13为40%;从免疫攻毒保护试验攻毒死亡小鼠肝脏中均分离出了相应的Pm。结论:从新疆北疆部分地区规模化牛场疑似病例中分离的Pm主要血清型为A:L3:ST1型,并初步筛选出了1株毒力强且具有良好抗原性的菌苗候选株,为进一步研发Pm菌苗奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
•   1 研究目的及意义
•   2 国内外研究进展综述
•     2.1 病原
•     2.2 分型
•     2.3 流行病学
•     2.4 相关毒力因子的研究
•     2.5 Pm疫苗的研究进展
• 第二章 试验研究
•   试验一 牛源Pm分子分型的研究
•     1 材料
•       1.1 病料来源及试验动物
•       1.2 主要试剂及培养基
•       1.3 主要仪器
•     2 方法
•       2.1 分离菌株的培养、镜检及生化鉴定
•       2.2 分离菌株16S rRNA及 kmt特异性基因的PCR鉴定
•       2.3 Pm荚膜血清型、脂多糖型的鉴定
•       2.4 Pm管家基因的PCR扩增及MLST分析
•     3 结果
•       3.1 分离菌株的培养特性、镜检及生化鉴定结果
•       3.2 分离菌株16S rRNA及 kmt特异性基因的PCR鉴定结果
•       3.3 Pm荚膜血清型、脂多糖型鉴定结果
•       3.4 Pm管家基因的PCR扩增及MLST分型结果
•     4 讨论
•       4.1 牛源Pm的 LPS-mPCR及荚膜分型
•       4.2 牛源Pm的 MLST分型
•     5 小结
•   试验二 牛源多杀性巴氏杆菌毒力评价
•     1 材料
•       1.1 菌株与实验动物
•       1.2 主要试剂及培养基
•       1.3 主要仪器
•     2 方法
•       2.1 Pm毒力基因的检测
•       2.2 Pm耐药基因的检测
•       2.3 药物敏感性试验
•       2.4 小鼠致病性试验
•       2.5 小鼠LD50 的测定
•       2.6 感染死亡小鼠病理切片制作及病理观察
•     3 结果
•       3.1 Pm毒力基因的检测
•       3.2 Pm耐药基因的检测
•       3.3 药物敏感性试验
•       3.4 小鼠致病性试验结果
•       3.5 小鼠LD50 的测定结果
•       3.6 感染小鼠病理观察结果
•     4 讨论
•       4.1 关于Pm分离株致病性及毒力基因携带情况
•       4.2 关于Pm分离株耐药基因及耐药表型
•       4.3 关于Pm致病力、毒力基因及耐药基因的关系
•     5 小结
•   试验三 牛源Pm菌苗候选株的抗体水平检测及免疫攻毒保护试验
•     1 材料
•       1.1 菌株与试验动物
•       1.2 主要试剂及培养基
•       1.3 主要仪器
•       1.4 菌苗油相的制备
•     2 方法
•       2.1 灭活菌苗的制备
•       2.2 菌苗免疫小鼠及免疫保护试验
•       2.3 攻毒小鼠病原菌的分离及鉴定
•       2.4 间接ELISA方法测定抗体效价
•     3 结果
•       3.1 菌苗的检验
•       3.2 攻毒小鼠病原菌鉴定结果
•       3.3 菌苗的免疫保护试验
•       3.4 小鼠血清抗体效价检测结果
•     4 讨论
•       4.1 抗体水平及疫苗保护率
•       4.2 影响菌苗保护率的因素
•     5 小结
• 第三章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 邬琴

导师: 周霞,钟发刚,陶岳

关键词: 牛源多杀性巴氏杆菌,荚膜血清型,细菌分型,抗体效价,保护率

来源: 石河子大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 石河子大学

分类号: S852.61

DOI: 10.27332/d.cnki.gshzu.2019.000079

总页数: 58

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