长沙医学院口腔医学院2011级本科口腔三班湖南长沙410219
摘要：为研讨姜辣素与小白鼠复发性阿弗他溃疡的关系及其对阿弗他溃疡的影响机制。制作小白鼠阿弗他溃疡模型需通过化学灼烧法，模型制作后，溃疡黏膜的上下左右四个象限用注射针头蘸取龙胆紫标志其位置的大小面积，灌胃治疗，制作阿弗他溃疡模型石蜡切片，HE染色后经显微镜下观察小鼠口腔黏膜层和黏膜下层组织病理变化，将实验组和对照组进行对比。结果：姜辣素能减短阿弗他溃疡黏膜的愈合时长，提升阿弗他溃疡的治愈率，提高外周血中淋巴细胞和中性粒细胞的数量。结论：小白鼠阿弗他溃疡的加速愈合一定程度上受姜辣素的影响，促进外周血中的白细胞增殖可能与其影响机制相关。
关键词：姜辣素；阿弗他溃疡；化学灼烧
复发性阿弗他溃疡（recurrentaphthousulcer，RAU）是口腔粘膜病中最常见的溃疡性损害，可独立或多发，主要发生于唇、颊和舌缘粘膜，具有自限性、复发性、自愈性的特点。溃疡损害处有明显的灼热性疼痛症状，对患者的进食、说话有一定的影响，损害严重情况下会影响患者的工作与生活质量[1-3]。
但因复发性阿弗他溃疡是由多因素综合作用的结果，发病原因和致病机制也不明确，不同个体的病情严重程度、间隔期和持续时长存在明显差异，所以疗效并不理想。临床上很难得到根治，常常通过局部消炎和止痛来减短持续时长，延长发作的间隔期[4-5]。
近年来有研究发现姜辣素具有抗氧化、防腐抑菌和消炎等多方面作用，并且在动物胃溃疡实验中，姜辣素有一定抑制溃疡加重效果[6]。通过分析上述结论我们设想理论上姜辣素对阿弗他溃疡也可具有治疗效果。所以我们团队尝试建立阿弗他溃疡模型，利用现代化药理学的研究方法，进行姜辣素对阿弗他溃疡药物作用和影响机制的相关研究和讨论。
1.仪器与材料
电子显微镜一台，型号MC-1180，厂家广州蔚仪金相试验仪器有限公司；
石蜡切片机一台，型号CUT4062，厂家上海珂淮仪器有限公司；
烘箱一台，厂家上海艾测电子科技有限公司；
40％冰醋酸、乙酸乙酯溶液、干姜粉，厂家广州市锦天化工科技有限公司；
小白鼠20只。
2.方法
2.1姜辣素的提取（乙酸乙酯提取法）：
根据粉液比例1：10，称干姜粉1.5，，浸泡在乙酸乙酯溶剂2小时，三次平均实验后将三份提取液合并进行离心处理（3600r/min的离心转速，持续15分钟），残渣废弃，分离取得上清液后减压抽滤，并放在500ml容量瓶内定容，提取出姜辣素粗品。
2.2阿弗他溃疡模型的制备：
2.2.1分组：
选16只小白鼠，要求体重在26-30g之间。将小白鼠随机分成四组，分别为实验组S1、S2、S3，对照组S4，每组4只。
2.2.2化学灼烧法制作阿弗他溃疡的模型：
用10％的水合氯醛给小鼠做腹腔麻醉，等麻醉起效后，拉开小鼠口角，暴露出口腔内侧的黏膜，使用直径4mm，厚约1mm的滤纸片浸泡于40%的冰醋酸，各把一张放在小鼠左右口腔的内侧。一分钟后取出可见该处有4.5mm的白色病损。在溃疡上下左右四个象限的黏膜上用注射针头蘸取龙胆紫刺入标记其面积大小，2天后便可出现局部溃疡病损[7]。
2.3灌胃
低剂量姜辣素：S1组（剂量为小鼠体重5‰）和S2组（剂量为小鼠体重10‰）。高剂量姜辣素：S3组（剂量为小鼠体重15‰），每天早晚各一次，持续两天。生理盐水：S4组（剂量为小鼠体重5‰），每天早晚各一次，持续两天。
2.4石蜡切片制作，HE染色，显微镜观察：
经过两天灌胃后，先肉眼观察其溃疡面积，再把标志的黏膜组织剪下并放在4％的甲醛液中固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、常规HE染色，经显微镜观察溃疡处病损程度和外周血中血细胞数量的变化。
2.5小鼠阿弗他溃疡损伤指数的测定：
根据以上步骤可获知溃疡处病损情况，按以下设置的标准来计算各组小鼠溃疡的损伤指数和溃疡治愈率：直径＜1mm的点状溃疡，每个计2分，如果直径＞1mm需要加倍计分。溃疡治愈率（%）=（对照组-实验组）的溃疡指数/对照组的溃疡指数×100%
3.结果
3.1小鼠口腔溃疡黏膜损伤程度与姜辣素的关系
实验结果表明：对照组小鼠的阿弗他溃疡面积大，损伤程度大，实验组（姜辣素）小鼠的阿弗他溃疡面积及损伤程度较对照组小，并且溃疡愈合时长比对照组短。随着剂量的增加，阿弗他溃疡愈合的时长也逐渐减短，所以实验组和对照组的结果均有一定的统计学意义（表一为实验结果）。使用姜辣素灌胃的实验组中，小鼠的口腔黏膜损伤指数比对照组低，随着剂量的增加，阿弗他溃疡的治愈率也随之提升，对照组和实验组结果相对比有一定的统计学意义（表二为实验结果）。
4.讨论
因为复发性阿弗他溃疡是多因素综合作用结果，病因不明确。近年来有大量研究表示阿弗他溃疡的最重要的发病机制是免疫因素，其中与复发性阿弗他溃疡的发生关联最突出的是细胞免疫应答。表明阿弗他溃疡的患者有T淋巴细胞亚群失衡和细胞免疫功能降低等表现。
本组实验中的模型是使用40％的冰醋酸进行化学灼烧，刺激小白鼠口腔黏膜，发生明显的充血和炎症，致其发生阿弗他溃疡。模型创建后，几乎能从肉眼观察到所有实验小白鼠口腔黏膜面有凹陷性缺损，平均直径4.3mm，较多黄色或白色坏死物存在于病损表面。经显微镜可观察到明显的溃疡病损，表面的鳞状上皮脱落、坏死，以及中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的大量浸润。肉芽组织的生成可发生在数天后，溃疡病损逐渐愈合，上皮进行增生修复，炎症随之消退。
经本实验研讨姜辣素与小白鼠复发性阿弗他溃疡的关系得出：经以上数据对比得出，使用姜辣素灌胃的各个剂量组的黏膜损伤指数较对照组明显降低，溃疡治愈率较对照组明显升高，并且于本实验中，姜辣素剂量相对较高组的外周血中的中性粒细胞和淋巴细胞的数量也存在明显提升。实验结果表明，姜辣素可以提升自身免疫因子水平，一定意义上促进阿弗他溃疡的治愈。
参考文献：
[1]马旭辉、孙黎飞.复发性阿弗他溃疡的基础研究与治疗现状.实用医药杂志.2006年10月第23卷第10期
[2]王月华.云南白药维生素E治疗阿弗他溃疡50例疗效观察[J].齐鲁药事.2006年05期
[3]石鹏展.复发性阿弗他溃疡的中医治疗与研究进展[J].陕西中医.2011年02期
[4]李源媛、王新文.复发性阿弗他溃疡的治疗研究进展.中国实验放剂学杂志.2011年6月17卷11期
[5]李奉华、刘虹.复发性阿弗他溃疡致病因素及机制的研究进展.中国现代医学杂志.2003年4月第13卷第7期
[6]姚瑞东.生姜的临床应用概述.中国中医药现代远程教育.2012年10卷01期：81-82
[7]李前进、王宇翔、尹艳艳.一种简便实用的阿弗他溃疡实验模型[J].安徽医科大学学报.2002（04）：327-328
[8]张军：通讯作者，任职于长沙医学院，从事病理教学和临床诊断工作。
课题基金：长沙医学院2014年院级大学生研究性学习和创新性实验计划项目