不同长度重叠子POP-PCR基因组步移技术建立与试剂盒设计

论文摘要

在没有必要进行全基因组测序的情况下,利用基因组步移技术获取已知序列的未知侧翼区域,是多数实验室的选择。目前已建立多种PCR基的基因组步移方法。我们前期建立了重叠子为10 bp的引物部分重叠PCR（Partially overlapping primer-based PCR,POP-PCR）,用于基因组步移。POP-PCR不需要进行任何其它操作,是一种实用性强的方法。本论文在前期研究的基础上,建立了9-bp与15-bp重叠子POP-PCR;研发了12-bp重叠子POP-PCR基因组步移试剂盒,并对其可行性进行了测试。主要研究结果如下:1、设计了9-bp与15-bp重叠子POP引物组各两组,每组POP引物由三条引物构成[POP-P（用于第一轮PCR）、POP-S（用于第二轮PCR）、POP-T（用于第三轮PCR）],其3’-端具有9-或15-bp的一致序列（即重叠子）。由于重叠子较短,后一轮POP引物的3’-端重叠子仅能在较低温度下退火至与前一轮PCR产物的重叠子位点。每个POP引物组的三条引物分别与三条特异性引物配套使用,进行三轮巢式PCR反应,用于获取已知序列的侧翼区域。每轮PCR中,最初的5个高严谨循环使特异性引物与已知序列内的互补位点结合,并向未知序列方向延伸,形成一系列目标单链;在随后一个仅有的低严谨循环中,随机引物与模板发生部分退火,形成5’-端含有POP引物的单链DNA池,其中目标单链的3’-端与特异性引物完全互补,而非目标单链不存在任何引物的完美退火位点。在接下来的1个高严谨循环中,目标单链在特异性引物的引导下转变成双链（两个3’-端分别与特异性引物或POP引物完全互补）,在此后的高严谨循环中,目标DNA分子被特异性引物与步移引物,按照常规特异性扩增模式进行指数扩增;非目标单链由于缺乏任何引物的完整互补位点,始终不能转变成双链DNA,因而不能扩增。利用POP-PCR对短乳杆菌NCL912的谷氨酸脱羧酶基因（gadA）位点,以及插入了潮霉素基因（hgy）的水稻基因组进行步移。结果表明,所有POP-PCR都可以获得清晰的目的片段,平均长度达1.5 kb。2、设计了12-bp重叠子POP-PCR基因组步移试剂盒。详细介绍了试剂盒的构成与操作方法,并利用阳性对照模板和人基因组模板对试剂盒进行了验证。结果表明,试剂盒能高效进行基因组步移,并具有通用性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 第1章 引言
•   1.1 通用序列
•   1.2 基因组步移技术
•     1.2.1 DNA文库筛选方法
•     1.2.2 PCR基 DNA步移方法
•       1.2.2.1 反向PCR
•       1.2.2.2 DNA末端修饰法
•       1.2.2.3 限制性不依赖的基因组步移技术
•       1.2.2.4 PCR产物的亲和捕获方法
•       1.2.2.5 环境DNA的步移
•   1.3 研究内容与意义
•     1.3.1 研究内容
•     1.3.2 研究意义
• 第2章 不同长度重叠子POP-PCR
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 实验材料
•       2.2.1.1 用于提取基因组DNA的材料
•       2.2.1.2 试剂
•       2.2.1.3 mMRS培养基
•       2.2.1.4 寡核苷酸引物
•       2.2.1.5 其它试剂的配置
•       2.2.1.6 设备
•     2.2.2 实验方法
•       2.2.2.1 细菌培养与gadA基因测试
•       2.2.2.2 基因组DNA分离纯化
•       2.2.2.3 人血液基因组DNA提取
•       2.2.2.4 PCR反应
•       2.2.2.5 核酸电泳
•       2.2.2.6 DNA测序
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 短乳杆菌NCL912的gadA基因确认
•     2.3.2 GABA基因组DNA提取
•     2.3.3 POP引物设计方法
•     2.3.4 特异性引物设计原则
•     2.3.5 POP-PCR的原理与过程
•     2.3.6 第一轮PCR第二阶段退火温度
•     2.3.7 第二轮、第三轮PCR第二阶段退火温度范围
•     2.3.8 POP-PCR歩移实验
•   2.4 本章小结
• 第3章 基于POP-PCR的试剂盒研发
•   3.1 引言
•   3.2 试剂盒设计
•     3.2.1 制品说明
•     3.2.2 试剂盒组成
•     3.2.3 特异性引物设计原则
•     3.2.4 实验时需要自备的其他材料
•     3.2.5 试剂盒步移与目标产物积累过程
•     3.2.6 试剂盒测试
•     3.2.7 注意事项
• 第4章 结论与展望
•   4.1 结论
•     4.1.1 POP-PCR方法的灵活性强、特异性高
•     4.1.2 设计了基因组步移试剂盒
•   4.2 创新点
•   4.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 谢茜

导师: 李海星,陈备战

关键词: 基因组步移,引物部分重叠,部分重叠引物,短乳杆菌基因组,水稻基因组,人基因组,基因组步移试剂盒

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 南昌大学

分类号: Q78

DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.002055

总页数: 70

文件大小: 2082K

下载量: 38