检测传染性支气管炎病毒的夹心ELISA方法的建立

论文摘要

传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是严重危害养鸡业的重要病原之一。IBV是一种冠状病毒,在复制过程中易发生突变,因而产生了许多抗原性及致病性有差异的变异株。由于IBV血清型众多,使得IBV的血清学诊断尤为困难。本研究以原核表达的IBV囊膜（M）蛋白的保守区肽段为免疫原,成功制备了针对M蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体,并最终建立了检测IBV的双抗体夹心ELISA方法,为IBV的临床诊断提供了简便、可靠的选择。1.IBVM蛋白的原核表达使用Protean软件对IBVCK/CH/JS/06Ⅱ毒株的M蛋白氨基酸序列进行分析,选取抗原性较好且在不同血清型毒株中相对保守的第158-223位氨基酸,设计相应引物,提取IBV总RNA,采用RT-PCR扩增IBV M基因。将M基因分别克隆至带有His标签的pET-32a（+）和带有GST标签的pGEX-6p-1表达载体,构建重组表达质粒pET-32a-M和pGEX-6p-1-M。将两个重组质粒分别转入表达菌株BL21（DE3）和BL21中,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE显示重组蛋白M-HIS和M-GST的大小分别为28 kD和33 kD,与预期相符。Western-blot鉴定结果显示,重组蛋白M-HIS和M-GST均能与IBV阳性血清特异性反应,说明两种重组蛋白均具有良好的免疫原性。2.IBVM蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体的制备以M-HIS重组蛋白免疫成年兔,200 μg/只,背部皮下多点注射,三次免疫后,耳缘静脉采血,制备血清。经间接ELISA方法检测,免疫兔的血清抗体效价达到了 1:102400。以M-HIS和M-GST重组蛋白分别作为免疫原和检测原,采用杂交瘤细胞技术,最终获得5株稳定分泌M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1B2、1D4、3E5、10G3、10D7。经间接ELISA检测,5株杂交瘤细胞在20代以内均能稳定分泌抗体;通过体内诱生法制备的腹水抗体效价均达到1:105;Westem-blot鉴定结果表明,5株单克隆抗体均能与QX型IBV M蛋白特异性结合;其中1B2反应谱最广,除QX型外,还能够与TW-1型、TC07-2型、Mass型和793/B型等其他四种常见血清型的IBV毒株反应。3.检测IBV的双抗体夹心ELISA方法的建立以多克隆抗体和单克隆抗体1B2分别作为捕获抗体和检测抗体,以M-His作为抗原,建立了双抗体夹心ELISA方法。试验反应条件优化为:捕获抗体最佳包被浓度为4 μg/mL,4℃包被过夜;检测抗体最佳工作浓度为2μg/mL;3%BSA封闭液37℃封闭60min;待检抗原37℃C孵育60min;HRP标记羊抗鼠IgG稀释度为1:10000,37℃C孵育60min;最佳底物反应时间为15 min。该方法建立的双对数回归拟合线线性相关系数大于0.99,通过回归方程确定定量分析M蛋白的检测范围50ng/ml～1.8μg/ml。批间、批内重复实验结果显示变异系数均小于10%,表明建立的方法具有良好的重复性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 禽传染性支气管炎的研究进展
•   1 IB的病原学
•     1.1 IBV的生物学特性
•       1.1.1 IBV的结构和基因组特征
•       1.1.2 IBV的结构蛋白及其功能
•       1.1.3 IBV的非结构蛋白（Nsp）及其功能
•   2 IB的流行病学
•     2.1 易感宿主
•     2.2 易感日龄和易感品种
•     2.3 IBV受体
•     2.4 传播方式
•     2.5 潜伏期
•     2.6 临床症状
•     2.7 组织病理学变化
•     2.8 发病率和死亡率
•   3 IBV的检测方法研究进展
•     3.1 血清学诊断方法
•     3.2 病毒分离
•       3.2.1 鸡胚培养
•       3.2.2 细胞培养
•       3.2.3 器官培养
•     3.3 电镜鉴定
•     3.4 免疫组织化学
•     3.5 分子生物学诊断
•       3.5.1 RT-PCR
•       3.5.2 RFLP
•       3.5.3 实时RT-PCR和其他PCR手段
•       3.5.4 测序与系统发育分析
•       3.5.5 单克隆抗体（McAb）
•   4 小结
• 第二章 检测传染性支气管炎病毒的夹心ELISA方法的建立
•   1 材料
•     1.1 载体与菌株
•     1.2 病毒、细胞及实验动物
•     1.3 主要生物试剂
•     1.4 主要试剂的配制
•       1.4.1 SDS-PAGE主要试剂配制
•       1.4.2 Western-blot主要试剂配制
•       1.4.3 ELISA主要试剂配制
•     1.5 主要实验仪器
•   2 方法
•     2.1 M蛋白的原核表达
•       2.1.1 IBV的增殖
•       2.1.2 IBV基因组RNA的提取
•       2.1.3 引物设计及合成
•       2.1.4 IBV M基因的扩增
•       2.1.5 重组质粒的构建
•       2.1.6 重组质粒的转化及鉴定
•       2.1.7 重组蛋白的诱导表达
•       2.1.8 Western-blot鉴定重组蛋白
•     2.2 多克隆抗体的制备与鉴定
•     2.3 单克隆抗体的制备
•       2.3.1 免疫原及检测原的制备
•       2.3.2 动物免疫
•       2.3.3 阳性杂交瘤细胞筛选方法的建立
•       2.3.4 小鼠血清抗体效价的测定
•       2.3.5 细胞融合
•       2.3.6 阳性细胞株的筛选
•       2.3.7 阳性细胞株的亚克隆
•       2.3.8 阳性细胞株的扩大培养、冻存与复苏
•       2.3.9 单克隆抗体的鉴定
•       2.3.10 腹水的制备及抗体效价的测定
•     2.4 双抗体夹心ELISA检测方法的建立
•       2.4.1 抗体纯化
•       2.4.2 ELISA基本操作方法
•       2.4.3 捕获抗体包被浓度和检测抗体工作浓度的确定
•       2.4.4 最佳封闭液浓度和封闭时间的确定
•       2.4.5 抗原最佳工作时间的确定
•       2.4.6 酶标抗体最佳工作浓度和工作时间的确定
•       2.4.7 底物显色液最佳工作时间的确定
•       2.4.8 重复性实验
•       2.4.9 双对数回归拟合线的绘制
•   3 结果
•     3.1 M蛋白的表达
•       3.1.1 IBV M基因片段的PCR扩增
•       3.1.2 重组质粒的构建
•       3.1.3 重组蛋白的诱导表达
•       3.1.4 Western-blot鉴定重组蛋白
•     3.2 多克隆抗体的效价检测
•     3.3 单克隆抗体的制备
•       3.3.1 重组蛋白的纯化
•       3.3.2 阳性杂交瘤细胞株筛选方法的建立
•       3.3.3 融合前小鼠血清效价的检测
•       3.3.4 细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选
•       3.3.5 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
•       3.3.6 单克隆抗体的鉴定
•       3.3.7 腹水的制备及效价测定
•     3.4 双抗体夹心ELISA检测方法的建立
•       3.4.1 抗体纯化
•       3.4.2 最佳捕获抗体包被浓度与检测抗体工作浓度的确定
•       3.4.3 最佳封闭条件的确定
•       3.4.4 抗原最佳工作时间的确定
•       3.4.5 酶标抗体最佳工作浓度和工作时间的确定
•       3.4.6 底物显色液最佳工作时间的确定
•       3.4.7 重复性实验
•       3.4.8 双对数回归拟合线的绘制
•   4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李敏

导师: 吴艳涛,张小荣,何海蓉

关键词: 鸡传染性支气管炎病毒,蛋白,单克隆抗体,双抗体夹心

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 国家重点研发计划项目(2017YFD0500703-2),国家自然科学基金面上项目(31872496),国家蛋鸡产业技术体系项目(CARS-40-K16),扬州大学“高端人才支持计划”(2016年度),江苏高校优势学科建设工程资助项目

分类号: S852.65

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000406

总页数: 58

文件大小: 2895K

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