Lefty1对小鼠胚胎干细胞分化过程的影响

论文摘要

目的:研究Lefty1在小鼠胚胎干细胞分化过程中的作用。方法:根据染色质免疫沉淀测序结果,在临近Lefty1转录起始位点以及与之相距10 kb的上游区域有TGF-β信号通路Smad2/3蛋白的四个结合区域,通过CRISPR/Cas9方法获得四个区域敲除的单克隆细胞,利用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测各细胞中Lefty1的转录水平,并用TGF-β信号通路的激活剂AC和抑制剂SB分别处理敲除的细胞,检测其对TGF-β信号的响应,最后通过胚状体形成实验,检测敲除细胞系在中内胚层分化过程中的标志分子Gsc和Mixl1的表达。结果:利用CRISPR/Cas9方法成功获得不同区域敲除的单克隆细胞,与野生型E14细胞相比,四种区域敲除的细胞中Lefty1 RNA含量明显降低,并且在干细胞状态和分化状态下,敲除细胞系对TGF-β信号的响应减弱。在胚状体形成的实验中,与野生型E14细胞相比,敲除细胞系在分化过程中Lefty1表达的基础水平明显降低,中内胚层分化的标志分子Gsc和Mixl1转录水平也明显下降。结论:在胚胎干细胞中,Lefty1转录起始位点附近以及上游10 kb的这四段区域通过TGF-β信号通路对Lefty1的转录发挥调控作用,从而影响中内胚层分化过程中的标志分子Gsc和Mixl1的表达。

论文目录

• 前言
• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•   1.2 方法
•     1.2.1 胚胎干细胞培养
•     1.2.2 胚状体 （Embryoid body, EB） 的形成
•     1.2.3 构建CRISPR/Cas9系统及筛选单克隆
•     1.2.4 实时荧光定量PCR检测基因的表达
•   1.3 统计学分析
• 2 结果
•   2.1 染色质免疫沉淀 （ChIP-seq） 测序结果
•   2.2 CRISPR/CAS9技术敲除的细胞系的鉴定及其对Lefty1转录的影响
•   2.3 Lefty1敲除细胞系对TGF-β信号的响应
•   2.4 Lefty1敲除细胞系对胚状体分化的影响
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 刘洋,杜晋,吴平,李轩,张璐

关键词: 信号通路,转录调控,胚胎干细胞分化

来源: 现代生物医学进展 2019年02期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,生物医学工程

单位: 清华大学生命科学学院

基金: 科技部-清华大学-北京大学生命学院联合中心基金项目

分类号: R318

DOI: 10.13241/j.cnki.pmb.2019.02.001

页码: 201-206

总页数: 6

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