人肝细胞生长因子突变体及其应用论文和设计-聂李亚

全文摘要

本申请涉及人肝细胞生长因子(hHGF)的突变体。本申请还涉及编码所述突变体的核酸分子，含有所述核酸分子的载体，含有所述核酸分子或载体的宿主细胞。本申请还涉及含有所述hHGF突变体的药物组合物，以及所述hHGF突变体的用途。

主设计要求

1.一种人肝细胞生长因子(humanhepatocytegrowthfactor,hHGF)的突变体，其与天然hHGF相比，区别在于下述突变：天然hHGF中对应于SEQIDNO:1的第130位的位置上的氨基酸被突变为具有碱性侧链的氨基酸。

设计方案

1.一种人肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)的突变体，其与天然hHGF相比，区别在于下述突变：天然hHGF中对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置上的氨基酸被突变为具有碱性侧链的氨基酸。

2.权利要求1的突变体，其具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述具有碱性侧链的氨基酸选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸；

(2)所述天然hHGF的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(3)所述突变体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2，3和4；

(4)所述突变体是经PEG化修饰的；

(5)所述hHGF突变体是通过重组表达的方法制备的，或者是通过化学合成的方法制备的；和

(6)所述hHGF突变体与天然hHGF相比，在选自下述的一个或多个方面显示更强的活性：(a)促进内皮细胞生长和\/或迁移；(b)促进血管发生；和\/或，(c)促进神经损伤修复。

3.权利要求2的突变体，其中，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

4.权利要求2的突变体，其中，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

5.权利要求2的突变体，其中，所述血管是微小血管。

6.权利要求2的突变体，其中，所述神经损伤是周围神经病变。

7.权利要求2的突变体，其中，所述神经损伤是糖尿病周围神经病变。

8.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-7任一项的突变体的核苷酸序列。

9.权利要求8的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子的核苷酸序列是根据宿主细胞偏好进行了密码子优化的。

10.权利要求9的分离的核酸分子，其中，所述宿主细胞为CHO细胞。

11.一种载体，其包含权利要求8-10任一项的分离的核酸分子。

12.权利要求11的载体，其中，所述载体具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述载体选自质粒；噬菌粒；柯斯质粒；噬菌体；以及，病毒载体；

(2)所述载体用于表达所述突变体；和

(3)所述载体是用于基因治疗的载体。

13.权利要求12的载体，其中，所述载体为质粒或病毒载体。

14.权利要求12的载体，其中，所述噬菌体为λ噬菌体或M13噬菌体。

15.权利要求12的载体，其中，所述病毒载体选自逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体。

16.权利要求15的载体，其中，所述逆转录病毒载体为慢病毒载体。

17.权利要求15的载体，其中，所述疱疹病毒载体为单纯疱疹病毒载体。

18.权利要求12的载体，其中，所述载体用于在受试者体内表达所述突变体。

19.权利要求18的载体，其中，所述受试者为哺乳动物。

20.权利要求18的载体，其中，所述受试者为人。

21.权利要求12的载体，其中，所述用于基因治疗的载体选自质粒，腺病毒载体，腺相关病毒载体，和慢病毒载体。

22.一种宿主细胞，其包含权利要求8-10任一项的分离的核酸分子或权利要求11-21任一项的载体。

23.权利要求22的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自原核细胞，以及真核细胞。

24.权利要求23的宿主细胞，其中，所述原核细胞为大肠杆菌细胞。

25.权利要求23的宿主细胞，其中，所述真核细胞选自酵母细胞，植物细胞和动物细胞。

26.权利要求25的宿主细胞，其中，所述动物细胞为昆虫细胞或哺乳动物细胞。

27.权利要求25的宿主细胞，其中，所述动物细胞选自小鼠细胞和人细胞。

28.制备权利要求1-7任一项的突变体的方法，其包括，在合适的条件下培养权利要求22-27任一项的宿主细胞，和从所述宿主细胞的细胞培养物中回收所述突变体。

29.权利要求28的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(1)构建表达载体，所述表达载体包含编码所述突变体的核酸序列；

(2)将所述表达载体导入宿主细胞中，并在允许蛋白质表达的条件下，培养所述宿主细胞；和

(3)从所述宿主细胞的细胞培养物中分离和回收所述突变体。

30.权利要求29的方法，其中，所述突变体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2，3和4。

31.权利要求29的方法，其中，所述宿主细胞为CHO细胞。

32.权利要求29的方法，其中，通过阴离子交换层析和肝素亲和层析来从所述宿主细胞的细胞培养物中分离和回收所述突变体。

33.一种药物组合物，其含有权利要求1-7任一项的突变体，以及任选地，药学上可接受的载体和\/或赋形剂。

34.权利要求1-7任一项的突变体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于治疗受试者中可受益于天然hHGF的活性的疾病；

所述疾病选自下肢动脉缺血和糖尿病周围神经病变。

35.一种在体外促进内皮细胞生长和\/或迁移的方法，其包括，给有此需要的内皮细胞施用有效量的权利要求1-7任一项的突变体或权利要求33的药物组合物。

36.权利要求35的方法，其中，所述内皮细胞为脐静脉内皮细胞。

设计说明书

技术领域

本申请涉及人肝细胞生长因子(hHGF)的突变体。本申请还涉及编码所述突变体的核酸分子，含有所述核酸分子的载体，含有所述核酸分子或载体的宿主细胞。本申请还涉及含有所述hHGF突变体的药物组合物，以及所述hHGF突变体的用途。所述hHGF突变体例如可用于促进内皮细胞生长和\/或迁移，促进血管发生，或治疗可受益于天然hHGF的活性的疾病(例如治疗下肢动脉缺血、心肌梗死和\/或糖尿病周围神经病变)，并因此可用于制备药物。

背景技术

肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)最初从大鼠血浆和血小板中分离得到,是一种分泌型肝素亲和糖蛋白,又称为扩散因子(Scatter factor,SF)。现已知HGF由间质细胞产生,与受体c-Met结合并激活该受体的酪氨酸激酶活性,促进肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、黑色素细胞、造血细胞等多种类型细胞的生长、迁移和形态发生。HGF在胚肝和胎盘的发育中起重要作用,参与维持和更新肝、肺、肾等器官的细胞,并促进这些器官的再生和损伤后修复。此外,HGF对不同来源的肿瘤细胞具有促侵袭或者生长抑制作用。因此,HGF是一种多功能细胞因子,具有广阔的临床应用前景。

成熟HGF是由重链(α链)与轻链(β链)通过链间二硫键连接而成的异二聚体，其中，α链含463个氨基酸,约69kD；β链含234个氨基酸,约34kD。α链的N-末端具有一个发夹结构,且靠近其C-末端具有4个纤溶酶样Kringle结构(依次称为K1、K2、K3、K4区),每个Kringle结构由约80个氨基酸组成。现已知,发夹结构和K1区是HGF与受体c-Met结合的关键部位；而发夹结构和K2区一起构成HGF与肝素及硫酸乙酰肝素亲和的必需结构；β链含有丝氨酸蛋白酶样折叠区,但没有丝氨酸蛋白酶活性。整个HGF分子共有4个N-糖基化位点,分别位于Asn294,Asn 402,Asn 566和Asn 653,重链和轻链各包含2个N-糖基化位点(肝细胞生长因子的分子生物学研究.生物工程学报，2002，18：1-4)。

C-Met是HGF的特异性细胞膜受体，表达于多种细胞，例如心肌细胞，血管内皮细胞等，介导HGF的生物学作用。HGF\/C-Met系统广泛表达于多种组织，并参与调节细胞的生长，运动以及组织形态发生等复杂的生物学过程。HGF是一种内皮生长因子，与其特异性受体C-Met相结合，引起受体的酪氨酸残基磷酸化，启动受体后信号传导过程；并且还引起ERK磷酸化，导致STAT3(Ser727)磷酸化形成二聚体进入核内，促进早期生长反应基因如c-fos表达，从而在转录水平调节细胞生长。研究还发现，HGF可以激活MEK，P42\/44MAPK以及P90RSR，减少过氧化氢引起的细胞死亡，并可以激活BCL-2基因表达并抑制Bax蛋白向线粒体膜表面移位，维持线粒体膜内外的电化学梯度，阻止线粒体内的细胞色素C漏出，抑制Caspase-3和Caspase-9的活性，产生抗细胞凋亡作用。HGF还可以刺激MMP-1，VEGF，HGF以及C-Met在血管内皮细胞和血管平滑肌细胞表达，并显著增加Ets-1的mRNA表达和转录活性，在新生血管形成过程中发挥重要作用(Angiogenic property of hepatocyte growth factor isdependent on upregulation of essential transcription factor for angiogenesis,ets-1.Circulation,2003,107：1411-1417)。Ets途径也是HGF促进血管生成的分子学机制之一(Therapeutic angiogenesis using hepatocyte growth factor.Current GeneTherapy,2004,4:199-206)。Ets家族转录因子具有结合DNA的结构域，能结合到DNA序列GGA的核心上，对多种参与促有丝分裂信号的基因的表达起到非常重要的作用，并且可能通过控制这些基因的转录而参与了血管生成的调节。HGF基因包含有许多调节区，例如B细胞和巨噬细胞特异的转录因子连接区，白介素26反应元件(IL26RE)，转移生长因子抑制元件(TNFIE)和cAMP反应元件(CRE)等。因此，外源HGF可以通过诱导ets活性刺激内源性HGF表达，而内源性HGF又能通过自动传导功能，促进小血管生成。

本申请发明人在研究后发现，可对hHGF进行突变，获得生物学活性增强的hHGF突变体。

发明内容

在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本申请，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“天然hHGF”和“野生型hHGF”是指具有生物学活性的、天然存在的人肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)，二者具有相同的含义，且可互换使用。可方便地从各种公共数据库(例如，GenBank数据库)获得天然hHGF或野生型hHGF的氨基酸序列。例如，天然hHGF的氨基酸序列可见于GenBank数据库登录号：NP_000592.3。

如本文中所使用的，当提及天然hHGF的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。例如，表述“天然hHGF的第130位氨基酸残基”是指，SEQ ID NO：1所示的蛋白的第130位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，天然hHGF可具有多种版本，它们具有基本上相同的一级结构(即，氨基酸序列)和高级结构(即，空间结构)，以及基本上相同的生物学功能，但是它们彼此之间在氨基酸序列上仍然可以存在微小差异。因此，在本申请中，天然hHGF并不局限于SEQ ID NO：1所示的蛋白，而意欲涵盖所有已知的天然hHGF。因此，在本申请中，术语“天然hHGF”应包括各种天然存在的、具有生物学功能的hHGF，包括例如SEQID NO：1所示的hHGF以及其天然存在的变体。并且，当描述hHGF的氨基酸位置时，其不仅包括SEQ ID NO：1中的特定氨基酸位置，还包括其天然变体中与所述特定氨基酸位置对应的氨基酸位置。例如，表述“天然hHGF的第130位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：1的第130位氨基酸残基，以及其天然变体中的相应氨基酸位置。根据本申请，表述“相应氨基酸位置”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的氨基酸位置。类似地，表述“对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置”是指，当对某一序列与SEQ ID NO:1进行最优比对时，即当某一序列与SEQ ID NO:1进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的该序列中位于与SEQ ID NO:1的第130位等同位置的氨基酸位置。

在某些优选的实施方案中，天然hHGF具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，天然hHGF是天然存在的、具有生物学功能的人肝细胞生长因子，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同一性。在某些优选的实施方案中，天然hHGF是天然存在的、具有生物学功能的人肝细胞生长因子，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸差异(例如，保守氨基酸置换)。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白\/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997),其通过引用并入本文)。

如本文中所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义，可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“具有碱性侧链的氨基酸”具有本领域技术人员通常理解的含义。氨基酸通常具有下述结构：

其中，R为侧链基团。

因此，当侧链基团R呈碱性时，该氨基酸即为具有碱性侧链的氨基酸。在具有碱性侧链的氨基酸的溶液中，所述氨基酸的侧链能够解离产生OH^{-<\/sup>，而呈现碱性。相应地，解离后的所述氨基酸侧链将携带有正电荷。因此，具有碱性侧链的氨基酸也被称为碱性氨基酸或侧链基团带正电荷的氨基酸。具有碱性侧链的氨基酸的典型实例包括但不限于，赖氨酸、精氨酸和组氨酸。}

如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体；以及，病毒载体等。可用作载体的病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的”意指，制药领域公认的可用于动物，特别是可用于人的。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和\/或赋形剂”是指在药理学和\/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和\/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂(包括但不限于磷酸盐缓冲液)，表面活性剂(包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80)，佐剂，离子强度增强剂(包括但不限于氯化钠)，稀释剂，赋形剂，用于容纳或施用治疗剂的介质，以及其任何组合。

如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂的典型实例包括但不限于，铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。

如本文中所使用的，药学上可接受的载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物的或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内施用药用组合物时，水是优选的载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射溶液。

如本文中所使用的，药学上可接受的赋形剂可包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，药物组合物还可以包含润湿剂，或乳化剂例如透明质酸钠，或pH缓冲剂。药物组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释配方等形式。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于，人，啮齿类动物(小鼠，大鼠，豚鼠)，狗，马，牛，猫，猪，猴，黑猩猩等。优选地，受试者是人。

如本文中所使用的，术语“可受益于天然hHGF的活性的疾病”是指这样的疾病，其中HGF的增强的表达和\/或活性能够缓解疾病的症状，迟滞疾病的进展，或治愈或部分治愈所述疾病。

如之前所报道的，HGF具有多种生物学活性，包括但不限于以下的一种或多种活性：(1)促进内皮细胞生长和\/或迁移；(2)促进血管(例如微小血管)发生；和\/或，(3)促进神经损伤(例如周围神经病变，例如糖尿病周围神经病变)修复。因此，HGF可在多个方面具有应用前景，包括但不限于：(1)促进内皮细胞生长和\/或迁移；(2)促进血管(例如微小血管)发生；(3)治疗缺血性疾病，例如冠状动脉疾病(CAD)或外周动脉疾病(PAD)，例如下肢动脉缺血；(4)治疗代谢综合征和糖尿病及其并发症(例如，糖尿病周围神经病变)；(5)抑制再狭窄；和(6)促进神经损伤(例如，神经退行性疾病，创伤性神经损伤，周围神经病变)修复。

因此，术语“可受益于天然hHGF的活性的疾病”的实例包括但不限于上述疾病，例如，缺血性疾病，代谢综合征，糖尿病及其并发症，再狭窄，神经损伤等等。

本申请发明人在研究后发现，可对天然hHGF进行突变，获得生物学活性增强的hHGF突变体。具体而言，本申请发明人发现，通过将天然hHGF的第130位氨基酸(以SEQ IDNO:1为参照)突变为具有碱性侧链的氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸、赖氨酸)，所产生的hHGF突变体具有比天然hHGF更强的生物学活性。

因此，在一个方面，本申请提供了一种人肝细胞生长因子(human hepatocytegrowth factor,hHGF)的突变体，其与天然hHGF相比，包含下述突变：天然hHGF中对应于SEQID NO:1的第130位的位置上的氨基酸被突变为具有碱性侧链的氨基酸。

在某些优选的实施方案中，所述具有碱性侧链的氨基酸选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。在某些优选的实施方案中，所述具有碱性侧链的氨基酸为精氨酸。在某些优选的实施方案中，所述具有碱性侧链的氨基酸为组氨酸。在某些优选的实施方案中，所述具有碱性侧链的氨基酸为赖氨酸。

在某些优选的实施方案中，所述天然hHGF具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，所述天然hHGF是天然存在的、具有生物学功能的人肝细胞生长因子，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同一性。在某些优选的实施方案中，所述天然hHGF是天然存在的、具有生物学功能的人肝细胞生长因子，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸差异(例如，保守氨基酸置换)。

在某些优选的实施方案中，所述突变体与SEQ ID NO:1所示的天然hHGF相比，包含下述突变：SEQ ID NO:1的第130位氨基酸(即，丝氨酸)被突变为精氨酸。在某些优选的实施方案中，所述突变体具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，所述突变体与SEQ ID NO:1所示的天然hHGF相比，包含下述突变：SEQ ID NO:1的第130位氨基酸(即，丝氨酸)被突变为组氨酸。在某些优选的实施方案中，所述突变体具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，所述突变体与SEQ ID NO:1所示的天然hHGF相比，包含下述突变：SEQ ID NO:1的第130位氨基酸(即，丝氨酸)被突变为赖氨酸。在某些优选的实施方案中，所述突变体具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

因此，在某些优选的实施方案中，所述突变体具有选自SEQ ID NO:2，3和4的氨基酸序列。

易于理解，可以对蛋白质进行各种修饰，以赋予蛋白期望的特性。例如，可以对蛋白质进行聚乙二醇修饰(PEG化修饰)，以改善蛋白质的体内半衰期。因此，在某些优选的实施方案中，所述突变体是经修饰的。在某些优选的实施方案中，所述突变体是经化学修饰的。在某些优选的实施方案中，所述突变体是经PEG化修饰的。

可通过各种已知的方法来制备本申请的hHGF突变体。在某些优选的实施方案中，所述hHGF突变体是通过重组表达的方法制备的。在某些优选的实施方案中，所述hHGF突变体是通过化学合成的方法制备的。然而，易于理解，本申请的hHGF突变体不受其制备方法所限制。

与天然hHGF相比，本申请的hHGF突变体具有更强的生物学活性。不拘于理论限制，本申请发明人认为，将位于天然hHGF的α链N-末端第一个发夹结构内的第130位氨基酸(以SEQ ID NO:1为参照)突变为具有碱性侧链的氨基酸(例如精氨酸、组氨酸、赖氨酸)，将会改变所述发卡结构的构象，增强hHGF蛋白与受体c-Met的结合，从而增强hHGF蛋白的生物学活性。因此，本申请的hHGF突变体可以在例如选自下述的一个或多个方面显示更强的活性：(1)促进内皮细胞生长和\/或迁移；(2)促进血管(例如微小血管)发生；和\/或，(3)促进神经损伤(例如周围神经病变，例如糖尿病周围神经病变)修复。

在另一个方面，本申请提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的突变体的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子编码具有选自SEQ ID NO:2，3和4的氨基酸序列的突变体。

易于理解，所述分离的核酸分子可以用于克隆或表达本发明的突变体。在某些情况下，为了提高效率，可以根据细胞偏好，对核酸分子的核苷酸序列进行密码子优化。因此，在某些优选的实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列是根据宿主细胞偏好进行了密码子优化的。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列是根据CHO细胞偏好进行了密码子优化的。

在另一个方面，本申请还提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。

本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在某些优选的实施方案中，本发明的载体可以是例如，质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体；以及，病毒载体等。可用作载体的病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。因此，在某些优选的实施方案中，本发明的载体是病毒载体，例如但不限于，逆转录酶病毒载体(例如慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体(如单纯疱疹病毒载体)、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体。在某些优选的实施方案中，本发明的载体选自腺病毒载体，腺相关病毒载体，和慢病毒载体。

在某些优选的实施方案中，本发明的载体能够表达或用于表达本发明的突变体。在某些优选的实施方案中，本发明的载体能够或用于在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的突变体。在某些优选的实施方案中，本发明的载体用于基因治疗。在某些优选的实施方案中，本发明的载体能够用作基因治疗载体，用于在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的突变体并进行基因治疗。

在另一个方面，本申请还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如CHO细胞。

在另一个方面，本申请还提供了制备本发明的突变体的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从所述宿主细胞的细胞培养物中回收本发明的突变体。

在某些优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(1)构建表达载体，所述表达载体包含编码本发明的突变体(例如，具有如SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的突变体)的核酸序列；

(2)将所述表达载体导入宿主细胞(例如CHO细胞)中，并在允许蛋白质表达的条件下，培养所述宿主细胞；和

(3)从所述宿主细胞的细胞培养物中分离和回收本发明的突变体。

在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，通过阴离子交换层析和肝素亲和层析来分离和回收本发明的突变体。

与天然hHGF相比，本申请的hHGF突变体具有更强的生物学活性，从而可有利地用作药物。因此，在另一个方面，本申请还提供了一种药物组合物，其含有本发明所述的突变体或核酸分子或载体，以及任选地，药学上可接受的载体和\/或赋形剂。

在某些优选的实施方案中，所述药物组合物含有本发明所述的突变体。在某些优选的实施方案中，所述突变体是未经修饰的。在某些优选的实施方案中，所述突变体是经修饰的，例如是PEG化修饰的。

在某些优选的实施方案中，所述药物组合物用于基因治疗。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物含有本发明所述的核酸分子或载体。在某些优选的实施方案中，所述载体是能表达本发明突变体的基因治疗载体，例如质粒，腺病毒载体，腺相关病毒载体，和慢病毒载体。

在某些优选的实施方案中，所述药学上可接受的载体和\/或赋形剂选自pH调节剂(包括但不限于磷酸盐缓冲液)，表面活性剂(包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80)，佐剂，离子强度增强剂(包括但不限于氯化钠)，稀释剂，赋形剂，用于容纳或施用治疗剂的介质，以及其任何组合。

在某些优选的实施方案中，所述药学上可接受的载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物的或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。在某些优选的实施方案中，药学上可接受的载体选自水，盐水溶液，水性右旋糖，甘油，以及其任何组合。

在某些优选的实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂可选自淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇，以及其任何组合。

在某些优选的实施方案中，所述药物组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂(例如冻干粉剂)、缓释配方等形式。

可通过各种合适的方式来施用本发明的药用组合物。合适的施用方式包括但不限于肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下、口腔、鼻内(例如吸入)、经皮(例如局部)、经粘膜、和直肠施用。在某些优选的实施方案中，依照常规流程将药物组合物配制成适合于静脉内、皮下、肌肉内、口腔、鼻内、或局部施用于人的药物制剂。

通常，用于注射(例如静脉内施用，例如通过推注或连续输液)的药物组合物是无菌、等渗的。如果需要，此类药物组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂诸如麦角胺，以减轻注射部位的疼痛。此外，用于注射的药物组合物还可以含有防腐剂。在某些优选的实施方案中，用于注射的药物组合物还可以以单位剂量形式存在(例如贮存在安瓿中或在多剂量容器中)。

用于注射的药物组合物可以采取诸如油性或水性介质中的悬浮液、溶液、或乳状液等形式，而且可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂、和\/或分散剂。或者，此类药物组合物还可以是粉末形式，其在使用前用合适介质(例如无菌、无热原水)溶解。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物为冻干注射剂，其含有0.01％-0.2％的hHGF突变体，以及5％的甘露醇，以及药学上可接受的载体。

可用于提供肠胃外剂量形式的合适介质对于本领域技术人员而言是众所周知的。在某些优选实施方案中，适于肠胃外剂量形式的介质包括但不限于注射用水；水性介质，包括但不限于氯化钠注射液、Ringer氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、以及乳酸化Ringer氏注射液；水易混介质，包括但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇；以及，非水性介质包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、和苯甲酸苯甲酯。

之前的研究已经表明，HGF能够刺激内皮细胞的生长，并且刺激其迁移(Bussolino等，J Cell Biol.119：629(1992)；Nakamura等，J Hypertens 14：1067(1996))；并且，HGF可用作再内皮化刺激剂(Yasuda等，Circulation 101：2546(2000)；Hayashi等，Gene Ther 7：1664(2000))。

还已发现，HGF可通过调节内皮细胞生长和血管平滑肌细胞迁移来刺激血管生成。因为其血管发生活性，HGF被认为是治疗性血管发生的有前景候选物。例如，之前的研究报道，HGF可用于治疗缺血性疾病，比如冠状动脉疾病(CAD)或外周动脉疾病(PAD)(Miyagawa等，Circulation 105：2556(2002)；Azuma等，Gene Ther.13：1206(2006)；Aoki等，GeneTher.7：417(2000)；Funatsu等，J.Thoracic Cardiovasc.Surg.124：1099(2002)))。

此外，还已报道，HGF能够改善糖尿病引起的血管并发症(Peng et al.，2011)，用于治疗代谢综合征和糖尿病及其并发症(例如，糖尿病周围神经病变)。

此外，还已报道，HGF可用作抑制再狭窄的药剂。研究表明，快速的内皮表面重建可抑制平滑肌细胞增殖，从而抑制再狭窄(Bauters等，Prog Cardiovasc Dis.40：107(1997))。向受损血管局部递送内皮生长因子(例如血管内皮生长因子(VEGF)或肝细胞生长因子(HGF))显示了抑制再狭窄的效果(Asahara等，Circulation 94：3291(1996)；Yasuda等，Circulation 101：2546(2000)；Hayashi等，Gene Ther 7：1664(2000)；Walter等，Circulation 110：36(2004))。

还已发现，HGF是一种在多个脑部区域有效的神经营养因子(Kato et al.，2009；Ebens et al.，1996)，能够影响多种类型的神经元细胞，包括运动神经元(Elsen et al.,2009；Hayashi et al.，2006)、海马神经元(Lim et al.，2008)、小脑颗粒细胞(Ieraci etal.，2002)和交感神经元(1999)，且能够同时刺激神经形成和突触发生(Shang et al.，2011；Wang et al，2011)。已报道，HGF\/c-Met信号传导能够促进神经元损伤愈合(Trappalet al.，2008)，特别是在局部缺血性脑损伤之后(Takeo et al.，2007)。还已报道，在患有家族性肌萎缩性侧索硬化(ALS)疾病的鼠科动物或大鼠模型中应用肝细胞生长因子(HGF)能够显著减慢运动神经元的退化(Aoki et al.，2009)；减少助于退化过程的神经胶质增生(Kadoyama et al.，2007)；延迟瘫痪的发生(Kadayama et al.，2009)；和增加寿命(Sun etal.，2002)。这些研究结果表明，HGF在多种神经疾病，例如神经退行性疾病(例如ALS，帕金森氏病，痴呆病)，创伤性脑损伤，创伤性脊髓损伤中具有治疗作用和神经保护作用。

因此，已显示HGF在多个方面具有应用前景，包括：(1)促进内皮细胞生长和\/或迁移；(2)促进血管(例如微小血管)发生；(3)治疗缺血性疾病，例如冠状动脉疾病(CAD)或外周动脉疾病(PAD)，例如下肢动脉缺血；(4)治疗代谢综合征和糖尿病及其并发症(例如，糖尿病周围神经病变)；(5)抑制再狭窄；和(6)促进神经损伤(例如，神经退行性疾病，创伤性神经损伤，周围神经病变)修复。本申请的hHGF突变体具有比天然hHGF更强的生物学活性，从而可有利地用于上述应用。

因此，在另一个方面，本申请提供了在受试者中治疗可受益于天然hHGF的活性的疾病的方法，其包括，给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的突变体或核酸分子或载体或药物组合物。

在某些优选的实施方案中，所述疾病选自缺血性疾病，代谢综合征，糖尿病及其并发症，再狭窄，以及神经损伤。在某些优选的实施方案中，所述疾病为缺血性疾病，例如冠状动脉疾病(CAD)或外周动脉疾病(PAD)，例如心肌梗死或下肢动脉缺血。在某些优选的实施方案中，所述疾病为糖尿病或其并发症，例如糖尿病周围神经病变。在某些优选的实施方案中，所述疾病为再狭窄，例如手术后再狭窄和灌注后再狭窄。在某些优选的实施方案中，所述疾病为神经损伤，例如神经退行性疾病(例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)，帕金森氏病，痴呆病)，创伤性神经损伤，周围神经病变(例如糖尿病周围神经病变)。在某些优选的实施方案中，所述疾病选自下肢动脉缺血、心肌梗死和糖尿病周围神经病变。

在某些优选的实施方案中，通过给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的突变体，从而治疗受试者的所述疾病(例如下肢动脉缺血、心肌梗死和\/或糖尿病周围神经病变)。在某些优选的实施方案中，所述突变体是未经修饰的。在某些优选的实施方案中，所述突变体是经修饰的，例如是PEG化修饰的。

在某些优选的实施方案中，通过给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的核酸分子或载体，从而治疗受试者的所述疾病(例如下肢动脉缺血、心肌梗死和\/或糖尿病周围神经病变)。在某些优选的实施方案中，所述载体是能表达本发明突变体的基因治疗载体，例如质粒，腺病毒载体，腺相关病毒载体，和慢病毒载体。

本领域普通技术人员知晓，施用的方式、频率和剂量将根据所治疗的病症、病况和个体的不同而异。一般来说，可以通过注射(例如皮内、肌内、静脉内或皮下)、局部施用(例如表皮施用)或滴加施用等方式施用。此外，还可以根据患者个体的不同，选择合理的施用途径和施用方案。合适的剂量为当施用上述的药物组合物后能够有效治疗所述疾病(例如下肢动脉缺血、心肌梗死和\/或糖尿病周围神经病变)的量。

对于含有本发明所述的突变体的药物组合物而言，单位剂量形式包含的量可以例如为大约10μg-5mg。合适的剂量将因患者病症以及给药方式而异，例如可以为大约1μg-100μg\/kg体重。

在另一个方面，本申请提供了本发明所述的突变体或核酸分子或载体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于治疗受试者中可受益于天然hHGF的活性的疾病。

在另一个方面，提供了本发明所述的突变体或核酸分子或载体或药物组合物，其用于治疗受试者中可受益于天然hHGF的活性的疾病。

在某些优选的实施方案中，所述突变体是未经修饰的。在某些优选的实施方案中，所述突变体是经修饰的，例如是PEG化修饰的。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子或载体用于基因治疗。在某些优选的实施方案中，所述载体是能表达本发明突变体的基因治疗载体，例如质粒，腺病毒载体，腺相关病毒载体，和慢病毒载体。

在另一个方面，本申请提供了促进内皮细胞生长和\/或迁移的方法，其包括，给有此需要的内皮细胞或受试者施用有效量的本发明所述的突变体或核酸分子或载体或药物组合物。

在某些优选的实施方案中，所述方法用于体内。例如，可将本发明所述的突变体或核酸分子或载体或药物组合物施用给受试者，以促进受试者体内的内皮细胞生长和\/或迁移。在某些优选的实施方案中，所述方法用于体外。例如，可将本发明所述的突变体或核酸分子或载体或药物组合物施用给体外培养的内皮细胞，以促进培养物中的内皮细胞生长和\/或迁移。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞为脐静脉内皮细胞。

在另一个方面，本申请提供了促进血管发生的方法，其包括，给有此需要的受试者施用有效量的本发明所述的突变体或核酸分子或载体或药物组合物。在某些优选的实施方案中，所述血管发生为微小血管发生。

在另一个方面，本申请提供了本发明所述的突变体或核酸分子或载体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于促进内皮细胞生长和\/或迁移或促进血管发生。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞为脐静脉内皮细胞。在某些优选的实施方案中，所述血管发生为微小血管发生。

在另一个方面，提供了本发明所述的突变体或核酸分子或载体或药物组合物，其用于促进内皮细胞生长和\/或迁移或促进血管发生。在某些优选的实施方案中，所述内皮细胞为脐静脉内皮细胞。在某些优选的实施方案中，所述血管发生为微小血管发生。

发明的有益效果

与天然hHGF相比，本申请的hHGF突变体具有更强的生物学活性。特别地，本申请发明人通过研究发现，本发明的hHGF突变体可以在例如下述方面显示更强的生物学活性：(1)促进内皮细胞生长和\/或迁移；(2)促进血管(例如微小血管)发生；和\/或，(3)促进神经损伤(例如周围神经病变，例如糖尿病周围神经病变)修复。

因此，本发明的hHGF突变体可以更有利地应用于以下一个或多个方面：(1)促进内皮细胞生长和\/或迁移；(2)促进血管(例如微小血管)发生；(3)治疗缺血性疾病，例如冠状动脉疾病(CAD)或外周动脉疾病(PAD)，例如下肢动脉缺血；(4)治疗代谢综合征和糖尿病及其并发症(例如，糖尿病周围神经病变)；(5)抑制再狭窄；和(6)促进神经损伤(例如，神经退行性疾病，创伤性神经损伤，周围神经病变)修复。

下面将结合附图和实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本申请，而不是对本申请的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本申请的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了，实施例1制备的4种目的蛋白(即，天然hHGF，130Arg-hHGF，130His-hHGF和130Lys-hHGF)的SDS-PAGE检测结果，其中，泳道1：天然hHGF；泳道2：130Arg-hHGF；泳道3：130His-hHGF；泳道4：130Lys-hHGF；泳道5：蛋白质分子量标记。

关于序列信息的说明

本发明涉及的序列的信息提供如下。

SEQ ID NO:1(天然hHGF的氨基酸序列)

QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHS<\/u>FLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS

SEQ ID NO:2(130Arg-hHGF的氨基酸序列)

QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHR<\/u>FLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS

SEQ ID NO:3(130His-hHGF的氨基酸序列)

QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHH<\/u>FLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS

SEQ ID NO:4(130Lys-hHGF的氨基酸序列)

QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHK<\/u>FLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本申请(而非限定本申请)的实施例来描述本申请。

除非特别指明，本申请中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本申请，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。

实施例1.hHGF以及其突变体的制备

天然hHGF的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)可见于NCBI登录号NP_000592.3。以SEQ IDNO:1为模板，设计如下3个hHGF突变体：

(1)将SEQ ID NO:1第130位的Ser突变为Arg，得到hHGF突变体130Arg-hHGF，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)将SEQ ID NO:1第130位的Ser突变为His，得到hHGF突变体130His-hHGF，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和

(3)将SEQ ID NO:1第130位的Ser突变为Lys，得到hHGF突变体130Lys-hHGF，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

选用CHO细胞偏好密码子，全基因合成分别编码天然hHGF(SEQ ID NO:1)与上述3个hHGF突变体(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4)的多核苷酸，并在其5’端引入限制性酶切位点和起始密码子，在其3’端引入限制性酶切位点以及终止密码子，从而获得编码天然hHGF以及各种突变体的核酸分子。

将如上述制备的核酸分子分别克隆入表达载体，并转化到CHO宿主细胞中。在允许外源蛋白质表达的条件下，培养经转化的CHO宿主细胞，然后收集培养物，并进行离心，从而得到含有目的蛋白(天然hHGF，130Arg-hHGF，130His-hHGF，或130Lys-hHGF)的上清液。按照制造商的说明书，使用阴离子交换层析介质(DEAE Sepharose Fast Flow，GE healthcare，17-0709-10)分离上清液中的目的蛋白，并且，使用肝素亲和层析介质(Heparin Sepharose6Fast Flow,GE healthcare，17-0998-01)进一步纯化目的蛋白。

通过非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳法(non-reduced SDS-PAGE，分子克隆实验指南，第四版)检测所获得的经纯化的目的蛋白，结果如图1所示。如图1所示，所获得的4种经纯化的目的蛋白(天然hHGF，130Arg-hHGF，130His-hHGF和130Lys-hHGF)的纯度均大于98％，可用于后续研究。

实施例2.hHGF突变体与天然hHGF的体外生物学活性的评价

本实施例通过体外内皮细胞迁移实验来评价hHGF突变体与天然hHGF对内皮细胞迁移的影响，以评价hHGF突变体与天然hHGF的体外生物学活性。

1.材料与方法

1.1蛋白样品

如上制备的hHGF突变体(130Arg-hHGF，130His-hHGF和130Lys-hHGF)与天然hHGF，临用时用生理盐水配制成所需浓度。

1.2细胞株

ECV304细胞株(脐静脉内皮细胞)，用于测试HGF生物活性。

1.3试剂

DMEM培养基：Hyclone提供。配制方法如下：取DMEM培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释至1000ml，再添加碳酸氢钠2.1g。然后，将配制的培养基除菌过滤，4℃保存。

完全培养基：取胎牛血清100ml，添加DMEM培养基至1000ml。

Transwells：Costar提供。

1.4仪器

二氧化碳细胞培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂提供，型号为HH.CP。

倒置显微镜：重庆光电仪器总公司提供，型号为XDS-1B。

超净工作台：苏州净化设备有限公司提供，型号为SW-CJ-1F。

台式细胞洗涤离心机：湖南星科科学仪器有限公司提供，型号为TDL-50B。

光学显微镜：重庆光电仪器总公司提供，型号为BP104。

1.5试验方法

根据“体外HGF活性检测试验”方法(The chemotactic effect of mixtures ofantibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.J.Exp.Med.,1962,115:453466)，进行细胞迁移试验。简言之，在迁移板下槽的每孔中加入600μl DMEM培养基，将Transwells浸没入其中。将经0.1％胰酶消化的ECV304细胞用含10％胎牛血清的1640培养基配成每1ml含1×10 ^{6<\/sup>个细胞的细胞悬液。每孔加入200μl细胞悬液，并在37℃孵育1h。然后，用600μl含有2微克天然hHGF或hHGF突变体的培养基替代迁移板下槽中的原DMEM培养基，并继续培养2h。培养后，将Transwells转移至另一加有20％多聚甲醛的孔中，固定细胞10min。用棉签轻轻搽去膜上的未迁移细胞，随后用结晶紫染色5min。用手术刀片小心取下膜，放在载玻片上(有细胞的一面向上)，用光学显微镜观察。另设不使用天然hHGF或hHGF突变体的空白对照。}

本试验使用迁移细胞计数来评价待测蛋白(天然hHGF或hHGF突变体)的生物学活性。用光学显微镜定量评价细胞迁移的方法如下：先在低倍(物镜4倍)光学显微镜下选取细胞分布均匀的区域，再用目镜中附加网格的中倍(物镜20倍)显微镜，随机连续挑选5个视野，计数迁移细胞。测定结果用统计学t检验方法进行分析和评价。

1.6统计分析

数据以均数±标准差设计图

人肝细胞生长因子突变体及其应用论文和设计

人肝细胞生长因子突变体及其应用论文和设计-聂李亚

全文摘要

主设计要求

设计方案

设计说明书

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