7-磷酸景天庚酮糖供应底盘细胞的构建与初步应用

论文摘要

7-磷酸景天庚酮糖（7-P-S）是初级代谢戊糖磷酸途径中的重要中间产物,同时也是联系多种天然活性次级代谢产物的节点化合物,在不同7-磷酸景天庚酮糖环化酶的催化作用下发生环化,参与C7N氨基环醇类化合物的天然合成。7-P-S作为代谢途径中间体,正常状态下经转醛酶催化与3-磷酸甘油醛（3-P-G）发生三碳转移反应,生成4-磷酸赤藓糖和6-磷酸果糖,难以获得积累。本论文通过改造大肠杆菌MG1655戊糖磷酸途径,高效积累了7-P-S,构建了C7N氨基环醇类化合物生物合成的前体供应底盘细胞,并通过在7-P-S供应底盘细胞中引入2-表-井冈霉醇酮（EV）合成酶基因实现了EV的体内合成。本论文分析了大肠杆菌MG1655中负责催化7-磷酸景天庚酮糖与3-磷酸甘油醛三碳转移反应的转醛酶基因talA和talB,对其进行了克隆和表达,并以7-P-S和3-P-G为底物对其酶学性质进行了表征。结果表明,TALA和TALB是在MG1655中负责催化该三碳转移反应的同工酶;在最适条件下,TALA和TALB的酶活力分别为2.46±0.12 U/mg和1.94±0.71 U/mg。为了减少天然代谢途径对7-P-S的消耗,实现7-P-S的积累,我们利用CRISPR-Cas9基因无痕编辑系统对大肠杆菌MG1655的戊糖磷酸途径进行了改造。通过构建目标基因敲除的工作质粒pTarget-talA29和pTarget-talB43,对转醛酶基因talA和talB进行了敲除,成功获得了7-P-S供应菌株MG1655ΔtalAΔtalB;其7-P-S积累量达到了129.84 mg/L,是野生型的42.6倍,为以7-P-S为底物的C7N氨基环醇类化合物的生物合成提供了充足的前体。在上述7-P-S供应底盘细胞中,我们表达了来源于放线菌（Actinomycetes mirum）的7-P-S环化酶基因amirA,在体外验证了其催化7-P-S生成2-表-井冈霉醇酮的催化能力;并通过pTrc99A蛋白表达载体和CRISPR-Cas9基因编辑方法将其引入MG1655ΔtalAΔtalB底盘细胞,成功获得了MG1655ΔtalAΔtalB（pTrc99a-amirA）（命名为MG-1）和MG1655ΔtalA::amirAΔtalB::amirA（命名为MG-2）两株用于2-表-井冈霉醇酮合成的工程菌株;发酵24 h后,MG-1和MG-2两种菌株发酵产物中EV的产量分别为86.43±7.68 mg/L和9.60±0.96 mg/L。本论文通过对大肠杆菌MG1655戊糖磷酸途径的改造,实现了7-P-S的积累,为合成C7N氨基环醇类药物提供了前体;并引入外源基因实现了EV的异源合成,为后续利用该底盘细胞合成目标产物提供了参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词列表
• 第一章 绪论
•   1.1 戊糖磷酸途径
•     1.1.1 戊糖磷酸途径简述
•     1.1.2 戊糖磷酸途径的生物学功能
•     1.1.3 戊糖磷酸途径在代谢工程中的应用
•   1.2 7-磷酸景天庚酮糖
•   1.3 7-磷酸景天庚酮糖环化产物
•     1.3.1 2-表-5-表井冈霉醇酮
•     1.3.2 2-表-井冈霉醇酮
•     1.3.3 去甲基-4-脱氧gadusol
•   1.4 本研究课题的内容和意义
• 第二章 大肠杆菌7-磷酸景天庚酮糖消耗酶的性质表征
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 试剂与仪器
•     2.2.2 培养基和相关溶液
•     2.2.3 实验菌株与质粒
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 转醛酶TALA和 TALB表达载体的构建
•     2.3.2 转醛酶的表达与纯化
•     2.3.3 转醛酶酶活测定
•     2.3.4 转醛酶的酶学性质及酶动力学测定
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 转醛酶表达载体的构建
•     2.4.2 转醛酶的表达纯化
•     2.4.3 转醛酶的酶学性质分析
•     2.4.4 转醛酶TALA和 TALB酶动力学测定
•   2.5 本章小结
• 第三章 7-磷酸景天庚酮糖供应底盘细胞的构建
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 试剂与仪器
•     3.2.2 培养基和相关溶液
•     3.2.3 菌株与质粒
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 基因敲除工作质粒的构建
•     3.3.2 大肠杆菌MG1655 转醛酶基因的敲除
•     3.3.3 发酵产物7-磷酸景天庚酮糖的测定
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 基因敲除工作质粒的构建
•     3.4.2 转醛酶基因的敲除
•     3.4.3 7-磷酸景天庚酮糖的测定
•   3.5 本章小结
• 第四章 2-表-井冈霉醇酮的体内合成
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 试剂与仪器
•     4.2.2 培养基和相关溶液
•     4.2.3 菌株与质粒
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 2-表-井冈霉醇酮合成酶的活性测定
•     4.3.2 2-表-井冈霉醇酮生物合成菌株的构建
•     4.3.3 发酵产物2-表-井冈霉醇酮的检测
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 2-表-井冈霉醇酮体合成酶体外活性的测定
•     4.4.2 两种发酵菌株的构建
•     4.4.3 发酵产物2-表-井冈霉醇酮的检测
•   4.5 本章小结
• 第五章 总结与展望
•   5.1 结论
•   5.2 主要创新点
•   5.3 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘辉

导师: 崔莉

关键词: 大肠杆菌,转醛酶,磷酸景天庚酮糖,基因敲除,表井冈霉醇酮

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 上海交通大学

分类号: Q78

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.002815

总页数: 81

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