南北极环境样品微生物多样性分析、病原拮抗菌筛选及新物种的鉴定

论文摘要

极地是世界上纬度最高的地区,具有低温、营养贫瘠、干旱、植被与动物稀少等特征的生态环境,然而极地微生物的多样性却非常高。这些微生物往往具有丰富的代谢多样性、适冷调控机制、低能量环境生存适应机制等,而独特的生理功能往往潜藏着非常大的应用价值。因此,极地地区是一个蕴含着丰富微生物资源的宝库。本研究从南北极环境中采集不同类型的样品,改进了实验室可培养方法对样品进行了细菌的分离工作,并对南极部分土壤样品进行了 16SrRNA扩增子高通量测序,分析了可培养细菌与未培养细菌的多样性及主要细菌类群的潜在价值,并从中筛选出具有抑制病原菌生长的拮抗细菌,最后对分离到的三株新物种进行了多相分类鉴定。本研究的采集样品包括北极新奥尔松地区（夏季7-8月）苔原土壤样品、南极（夏季1-2月）菲尔德斯半岛的土壤、淡水样品及南极难言岛的土壤样品等。在培养条件上,对温度、时间、营养浓度进行了改进,如4℃与15℃低温培养、延长培养时间为15-30 d、稀释R2A培养基至10-30%等。在上述培养条件下,共分离细菌约1,220株,其中北极苔原土壤样品分离菌株615株,北极沉积物样品分离菌株103株,南极菲尔德斯半岛土壤样品分离细菌278株,南极淡水样品分离菌株139株,南极罗斯海科研站土壤分离菌株85株。这些细菌在门水平上分布五大门:变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、奇异球菌门。在可培养细菌中,分离到潜在新菌302株,排重后为182个潜在新物种。通过分析发现,优势菌群具有很多特殊功能,如抵抗紫外辐射、低营养环境下的生存策略、对植物的促生作用、抗菌活性物质的产生及对低温环境的适应策略等,而这些功能的研究在农业、工业、医学等方面具有重要的应用价值。在细菌分离的同时,本研究对南极菲尔德斯半岛（中国长城站附近）的8个土壤样品进行了 16SrDNA高通量测序,并进行未培养细菌多样性的分析。结果显示,在测序所获得的536,890条序列中,约90%的细菌被分到7个主要的门:放线菌门、变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、疣微菌门。对各类样品进行多样性分析后发现,受采样的环境类型、地理位置等因素的影响,不同样品存在独特的细菌群落结构。通过点种法,以金黄色葡萄球菌与鲍氏不动杆菌作为病原指示菌,对分离到的菌株进行拮抗菌的筛选。最终筛选得到约30株具有抑菌效果的菌株,主要分布在放线菌门的Microbacterium、变形菌门的Pseudomonas、厚壁菌门的Bacillus及其他物种。对其中抗菌效果明显的菌株F01002、菌株3H14进行基因组草图测序,通过antiSMASH网站与KEGG对其进行抗菌活性物质的分析。最后本研究对三株潜在新物种进行了多相分类鉴定。对菌株E01020T命名为Pedobacter greatwallensis（长城站土地杆菌）,对菌株L53T命名为Hanstruepera crassostreae（牡蛎汉斯氏菌）,对菌株B3227T命名为alakalibacillus sediminis（沉积物嗜盐嗜碱芽孢杆菌）。本论文的研究意义在于拓宽了极地地区微生物多样性的研究范围,获得了丰富的极地细菌资源,并分析了其潜在的研究价值,为后期深入挖掘极地微生物的功能提供了丰富的研究材料。在目前极地土壤细菌的抗菌活性研究较少的情况下,本研究从极地土壤中筛选到了具有较好活性的拮抗菌株,为接下来进一步提取新型抗菌物质提供了菌株资源。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 绪论
•   1.1 南北极地区陆域环境特点概况
•     1.1.1 北极地区陆域环境特点
•     1.1.2 南极地区陆域环境特点
•     1.1.3 极地环境的改变及变化趋势
•   1.2 极地陆域生境的细菌的研究概况
•     1.2.1 极地细菌多样性研究进展
•     1.2.2 极地细菌潜在的研究价值
•   1.3 极地细菌分离方法的研究进展
•     1.3.1 常规可培养方法的改进
•     1.3.2 新型可培养方法的发展
•   1.4 细菌抗菌活性的研究状况
•   1.5 立项依据
• 第二章 极地可培养细菌的分离与多样性分析
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 样品采集
•     2.1.2 培养基
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 主要仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 样品稀释涂布培养及富集培养
•     2.2.2 细菌的分离纯化
•     2.2.3 基于16S rDNA测序的菌株鉴定
•   2.3 实验结果与分析
•     2.3.1 极地可培养细菌的多样性分析
•     2.3.2 可培养细菌中的潜在新菌分析
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• 第三章 基于16S高通量测序对南极土壤微生物多样性的分析
•   3.1 实验方法
•     3.1.1 Illumina MiSeq高通量测序及序列拼接
•     3.1.2 OTU聚类
•     3.1.3 Beta多样性分析
•   3.2 实验结果及分析
•     3.2.1 样本测序数据统计
•     3.2.2 Alpha多样性分析
•     3.2.3 群落物种组成分析
•   3.3 讨论
•   3.4 本章小结
• 第四章 极地拮抗菌的筛选与功能分析
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验菌株
•     4.1.2 培养基
•     4.1.3 仪器与设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 拮抗菌的初筛
•     4.2.2 拮抗菌的复筛
•     4.2.3 拮抗菌的基因组分析
•   4.3 实验结果与分析
•     4.3.1 拮抗菌的初筛实验结果
•     4.3.2 拮抗菌的复筛实验结果
•     4.3.3 菌株F01002、3H14的基因组分析
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 第五章 三株新菌的多相分类
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 实验菌株
•     5.1.2 培养基
•     5.1.3 主要试剂
•     5.1.4 主要仪器
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 分子遗传学鉴定
•     5.2.2 形态特征分析
•     5.2.3 生理生化分析
•     5.2.4 化学成分测定
•     5.2.5 菌株保藏与命名
•   5.3 实验结果与分析
• T的鉴定'>    5.3.1 长城土地杆菌（Pedobacter greatwallensis）E01020^T的鉴定
• T的分类鉴定'>    5.3.2 牡蛎汉斯氏菌（Hanstruepera crassostreae）L53^T的分类鉴定
• T的分类鉴定'>    5.3.3 沉积物嗜盐嗜碱芽抱杆菌（Halakalibacillus sediminis）B3227^T的分类鉴定
•   5.4 本章小结
• 第六章 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 资助情况
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 贺瑞含

导师: 杜宗军,李会荣

关键词: 细菌分离,高通量测序,细菌多样性,拮抗菌,新物种鉴定

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山东大学

基金: 国家海洋局极地科学重点实验室开放研究基金(批准号KP201705),国家自然科学基金(项目号31770002)

分类号: Q939.9

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