大肠杆菌二核苷酸环化酶催化c-di-GMP生物合成

论文摘要

环二鸟苷酸（bis-（3’-5’）-cyclic dimeric guanosine monophosphate, c-di-GMP）是广泛存在于细菌中的第二信使分子,可通过STING （stimulator of interferon genes）信号通路参与先天免疫应答,是一种潜在的疫苗佐剂。为明确其先天免疫调节机制和评估免疫佐剂效果,c-di-GMP的高效合成急需解决。为建立一种相对简单、高效的c-di-GMP生物合成方法 ,实现体外制备c-di-GMP,本研究构建大肠杆菌（Escherichia coli）二核苷酸环化酶（dinucleotide cyclase V, DncV）重组表达载体,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG）诱导表达和His亲和纯化获得目的蛋白DncV;利用超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography, UPLC）检测DncV重组蛋白体外催化GTP生成c-di-GMP的反应。研究结果表明,IPTG诱导型表达载体pET-28a-His-DncV构建成功,亲和纯化获得的DncV重组蛋白纯度达到92%;该重组蛋白能够通过酶促反应一步生成c-di-GMP;金属离子对该酶活性影响显著,其中3种金属离子(Mg2+, Mn2+, Co2+)可提高催化效率,另外7种金属离子(Cu2+, Zn2+, Ni2+, Mo2+, Bo2+, Fe2+, Ca2+)抑制酶促反应。本研究建立了E. coli DncV重组蛋白催化合成c-di-GMP的方法体系,为c-di-GMP的大规模制备和功能研究提供了基础资料。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 菌株、载体与主要试剂
•   1.2 引物合成
•   1.3 目的序列的扩增
•   1.4 重组表达载体的构建和鉴定
•   1.5 大肠杆菌DncV的表达与纯化
•   1.6 c-di-GMP的生物合成
•   1.7 不同金属离子对大肠杆菌DncV酶活性的影响
•   1.8 金属离子浓度对大肠杆菌DncV酶活性的影响
•   1.9 反应缓冲液和反应温度对大肠杆菌DncV酶活性的影响
•   1.1 0 统计学分析
• 2 结果与分析
•   2.1 DncV重组表达载体的构建与鉴定
•   2.2 大肠杆菌DncV的表达与纯化
•   2.3 c-di-GMP生物合成
•   2.4 金属离子对大肠杆菌DncV酶活性的影响
•   2.5 反应缓冲液和反应温度对大肠杆菌DncV酶活性的影响
•   2.6 金属离子浓度对大肠杆菌DncV酶活性的影响
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 贾宾,张维,郭豫杰,孔江南,杨雪宸,庞博文,杨国宇,郑悦亭

关键词: 大肠杆菌,生物合成,重组表达,酶促反应

来源: 农业生物技术学报 2019年07期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 河南农业大学牧医工程学院

基金: 国家重点研发计划(No.2017YFD0501100)

分类号: Q78

页码: 1275-1281

总页数: 7

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