核仁素抑制小反刍兽疫病毒复制的分子机制

论文摘要

小反刍兽疫（Peste des Petits Ruminants,PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV）引起的一种急性、高度传染性、致命性疾病,主要感染偶蹄小反刍动物。该病主要表现为发热,口腔炎,肺炎,结膜炎,眼鼻粘膜脓性分泌物,严重腹泻,高发病率和死亡率。PPRV属于副黏病毒科麻疹病毒属,其基因组编码6个结构蛋白和2个非结构蛋白。虽然PPRV各蛋白的结构、功能等分子生物学的相关研究已经取得进展,但其分子致病机制和免疫机制仍然缺乏相关信息。而病原与宿主的互作是研究其分子致病机制的途径,目前PPRV该方面的研究比较少。本论文以病毒与宿主蛋白的互作为切入点,研究核仁素在小反刍兽疫病毒复制过程中的作用及其机制。PPRV N蛋白高度保守且免疫原性最高,在病毒复制和细胞趋向性中发挥重要作用。另外,PPRV N蛋白与许多宿主调节因子相互作用。因此,本研究旨在通过免疫共沉淀实验及质谱分析筛选与PPRV N蛋白互作的宿主蛋白。我们成功的筛选到了宿主分子核仁素（NCL）,随后通过Co-IP、GST-pull down实验进一步证实了NCL与N蛋白的直接相互作用。激光共聚焦实验结果显示NCL与PPRV N蛋白共定位于细胞核内。通过构建PPRV N蛋白及NCL的截短真核表达质粒并分别进行Co-IP实验,我们成功鉴定了N蛋白与NCL互作的功能域。实验结果证明核仁素的CTD域介导其与N蛋白的相互作用,而N蛋白的NTD域介导其与NCL的相互作用。其次,我们利用慢病毒包装系统成功构建了NCL过表达细胞系,为研究NCL在PPRV生长过程中的作用奠定了基础。当在Vero-SLAM细胞过表达NCL时,PPRV N蛋白的表达量降低、病毒基因组拷贝数减少且病毒滴度降低;而通过siRNA下调内源性NCL后,PPRV N蛋白的表达量增加、PPRV的基因组拷贝数增加且病毒滴度上升。由此可见,NCL在PPRV复制过程中发挥负调控作用。并且,我们通过双荧光素酶实验初步发现NCL促进IFN-β的产生。综上所述,本研究首次发现NCL与PPRV N蛋白相互作用,并且NCL是PPRV复制过程中的一个负调控因子。我们的研究结果表明NCL可能通过调控PPRV的复制而影响PPRV的发病机制,这将有助于我们了解PPRV的感染机制。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 小反刍兽疫概况
•   1.2 小反刍兽疫病原学
•     1.2.1 PPRV基因组结构
•     1.2.2 PPRV基因组长度“六碱基规律”
•     1.2.3 PPRV编码蛋白的功能
•     1.2.4 PPRV的复制机理
•   1.3 PPRV疫苗研究进展
•     1.3.1 弱毒疫苗
•     1.3.2 PPRV重组标记疫苗
•     1.3.3 多价疫苗
•     1.3.4 小结
•   1.4 核仁素
•     1.4.1 核仁素概述
•     1.4.2 核仁素的亚细胞定位及其相关功能
•     1.4.3 核仁素与肿瘤发生的关系
•     1.4.4 核仁素与病毒感染的关系
•     1.4.5 小结
•   1.5 研究目的及意义
• 第二章 核仁素与小反刍兽疫病毒N蛋白的相互作用
•   2.1 材料
•     2.1.1 质粒、病毒、菌株和细胞
•     2.1.2 主要试剂和仪器
•     2.1.3 设计引物
•   2.2 方法
•     2.2.1 质粒构建
•     2.2.2 细胞转染
•     2.2.3 免疫共沉淀
•     2.2.4 GST-Pull down
•     2.2.5 Western Blotting
•     2.2.6 共聚焦实验
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 免疫共沉淀实验钓取与PPRV N互作的内源性蛋白
•     2.3.2 免疫共沉淀实验验证内源性核仁素与PPRV N互作
•     2.3.3 核仁素与PPRV N蛋白在体外存在相互作用
•     2.3.4 GST-Pull down验证核仁素与PPRV N蛋白的体外直接相互作用
•     2.3.5 PPRV N蛋白的NTD区域介导其与NCL互作
•     2.3.6 NCL的 CTD区域介导其与PPRV N蛋白互作
•     2.3.7 NCL与 PPRV N蛋白在细胞核内存在共定位
•   2.4 讨论
• 第三章 核仁素抑制小反刍兽疫病毒复制的分子机制研究
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 质粒、病毒、菌株和细胞
•     3.1.2 主要试剂、主要仪器
•     3.1.3 NCL过表达细胞系
•     3.1.4 siRNA及质粒转染
•     3.1.5 RT-qPCR
•     3.1.6 BCA蛋白定量
•     3.1.7 病毒滴定实验
•     3.1.8 双荧光素酶实验
•   3.2 结果
•     3.2.1 siNCL对 PPRV复制的影响
•     3.2.2 过表达核仁素对PPRV复制的影响
•     3.2.3 PPRV在 NCL过表达细胞系复制情况检测
•     3.2.4 NCL对 PPRV在山羊子宫内膜上皮细胞的复制情况检测
•     3.2.5 NCL对 IFN-β的影响
•   3.3 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 董丹丹

导师: 刘光清

关键词: 小反刍兽疫病毒,蛋白,核仁素,复制,干扰素

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家重点研发计划(no.2016 YFD 0500108)

分类号: S852.65

总页数: 59

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