全文摘要
本发明公开了一种贝类高F值寡肽的制备方法，包括以下步骤：将贝肉洗净后匀浆，然后进行酶解，获取上层酶解液。以树枝状聚合物制备分子印迹材料，吸附酶解液中的芳香族氨基酸，得到高F值寡肽溶液，采用冷冻干燥制备高F值寡肽粉末。本发明产品原料易得且廉价，制备方法简单，便于工业化生产，产品得率75%以上，F值50以上，可作为肝病病人的膳食来源成分。
主设计要求
1.一种贝类高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括蛋白酶解、芳香族氨基酸专一吸附剂制备、芳香族氨基酸脱除，所述芳香族氨基酸专一吸附剂为分子印迹聚合物；所述蛋白酶解包括如下步骤：(1)取新鲜贝肉洗净，按照贝肉与水的质量比1：5-1：10加水匀浆，得到浆料；(2)向步骤(1)得到的浆料中加入内切蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量1000-3000U\/g，pH5-8，酶解温度30-50℃，酶解时间5-10h，然后煮沸5-15min灭酶，得到酶解液；(3)向步骤(2)获得的酶解液中，加入外切蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量1000-2000U\/g，pH5-8、酶解温度30-55℃，酶解时间8-12h，然后煮沸5-15min灭酶，3000-8000r\/min离心5-30min，收集上清液，得到贝类寡肽溶液；所述分子印迹聚合物的制备方法包括如下步骤：(1)0.5代树枝状聚酰胺-胺制备：以乙二胺为核，进行Michael加成反应，制备0.5代树枝状聚酰胺-胺；(2)1代树枝状聚酰胺-胺制备：以0.5代树枝状聚酰胺-胺和乙二胺进行酰胺化缩合反应制备1代树枝状聚酰胺-胺；(3)2代树枝状聚酰胺-胺制备：对步骤(2)获得的1代树枝状聚酰胺-胺重复进行步骤(1)中的Michael加成和步骤(2)中的酰胺化缩合反应，制备2代树枝状聚酰胺-胺；(4)端双键树枝状聚合物的制备：由2代树枝状聚酰胺-胺和丙烯酰氯进行胺解反应即得到端双键树枝状聚酰胺-胺;(5)分子印迹聚合物合成：以芳香族氨基酸作为模板，与步骤(4)中获得的端双键树枝状聚酰胺-胺合成，即得分子印迹聚合物；所述芳香族氨基酸脱除包括如下步骤：向所述蛋白酶解后的产物中添加其1-5wt%分子印迹聚合物，10-20℃搅拌30-100min，4000-10000r\/min离心5-30min，收集上清液，获得高F值寡肽溶液。
设计方案
1.一种贝类高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括蛋白酶解、芳香族氨基酸专一吸附剂制备、芳香族氨基酸脱除，所述芳香族氨基酸专一吸附剂为分子印迹聚合物；
所述蛋白酶解包括如下步骤：
(1)取新鲜贝肉洗净，按照贝肉与水的质量比1：5-1：10加水匀浆，得到浆料；
(2)向步骤(1)得到的浆料中加入内切蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量1000-3000U\/g，pH 5-8，酶解温度 30-50℃，酶解时间 5-10 h，然后煮沸5-15min灭酶，得到酶解液；
(3)向步骤(2)获得的酶解液中，加入外切蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量1000-2000U\/g，pH 5-8、酶解温度 30-55℃，酶解时间 8-12 h，然后煮沸5-15min灭酶，3000-8000r\/min离心5-30min，收集上清液，得到贝类寡肽溶液；
所述分子印迹聚合物的制备方法包括如下步骤：
(1)0.5代树枝状聚酰胺-胺制备：以乙二胺为核，进行Michael加成反应，制备0.5代树枝状聚酰胺-胺；
(2)1代树枝状聚酰胺-胺制备：以0.5代树枝状聚酰胺-胺和乙二胺进行酰胺化缩合反应制备1代树枝状聚酰胺-胺；
(3)2代树枝状聚酰胺-胺制备：对步骤(2)获得的1代树枝状聚酰胺-胺重复进行步骤(1)中的Michael加成和步骤(2)中的酰胺化缩合反应，制备2代树枝状聚酰胺-胺；
(4)端双键树枝状聚合物的制备： 由2代树枝状聚酰胺-胺和丙烯酰氯进行胺解反应即得到端双键树枝状聚酰胺-胺;
(5)分子印迹聚合物合成：以芳香族氨基酸作为模板，与步骤(4)中获得的端双键树枝状聚酰胺-胺合成，即得分子印迹聚合物；
所述芳香族氨基酸脱除包括如下步骤：
向所述蛋白酶解后的产物中添加其1-5wt%分子印迹聚合物，10-20℃搅拌30-100min，4000-10000r\/min离心5-30min，收集上清液，获得高F值寡肽溶液。
2.根据权利要求1所述的贝类高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述分子印迹聚合物的制备方法中步骤(1)的Michael加成反应，其工作条件为：将9份乙二胺和32 份甲醇加入到带有磁力搅拌子、回流冷凝管和温度计的三口烧瓶中,15-30℃ 通氮气5-20 min除氧，搅拌条件下，滴加103.2 份丙烯酸甲酯，反应10-30 h，在20-35 ℃,100-200 Pa的压力下减压蒸馏，除去溶剂甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得0.5代树枝状聚酰胺-胺；
所述分子印迹聚合物的制备方法中步骤(2)的酰胺化缩合反应，其工作条件为：将20.2份 步骤(1)中获得的0.5代树枝状聚酰胺-胺和64 份甲醇混合，15-30℃ 搅拌条件下,滴加72 份乙二胺,反应10-30 h，在45-75℃,100-300 Pa 的压力下减压蒸馏,除去溶剂甲醇和乙二胺，得到1.0代树枝状聚酰胺-胺；
所述分子印迹聚合物的制备方法中步骤(4)的工作条件为：称取1份2代树枝状聚酰胺-胺和8-16份丙烯酰氯，用二氯甲烷溶解，通氮气保护，避光2-4℃反应1-3h，得到具有沉淀物的溶液，低温过滤，得到端双键树枝状聚酰胺-胺产物；
所述分子印迹聚合物的制备方法中步骤(5)的工作条件为：称取1份芳香族氨基酸作为模板分子，加入5-10份乙醇，滴加50-200 µL 37wt%的盐酸使模板分子全部溶解；加入3-8mmo1步骤(4)中获得的端双键树枝状聚酰胺-胺，溶解，于冰水浴中作用5-10h后加入功能单体与引发剂，超声混合均匀，充氮气3-15min，然后置于冰水浴中进行紫外光引发聚合；聚合完成后将所得产物粉碎、研磨，用甲醇和乙酸除去模板分子，真空干燥后备用；所述功能单体为甲基丙烯酸，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
3.根据权利要求1或2所述的贝类高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述芳香族氨基酸为酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸。
4.根据权利要求1所述的贝类高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述贝类为栉孔扇贝、虾夷扇贝或海湾扇贝。
5.根据权利要求1所述的贝类高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述高F值寡肽的F值为50以上。
设计说明书
技术领域
本发明涉及生物肽制备领域，具体涉及一种贝类高F值寡肽的制备方法。
背景技术
高F 值寡肽是蛋白酶作用于食物蛋白质后形成的一种低分子量生理活性肽,由支链氨基酸含量高和芳香族氨基酸含量低的特殊氨基酸组成。F 值（Fischer ratio），是支链氨基酸与芳香族氨基酸含量的摩尔数比值。一般认为，用于临床治疗肝性脑病的高F 值寡肽的F 值应大于20。
正常人的血液中F 值为3.0-3.5，而患有肝脏疾病病人的F 值只有1.0 或者更低。对于肝病患者来说，其血浆F 值可以反映出患者肝病的严重程度。高F 值寡肽可用于防止肝性脑病的发生或减缓其症状，同时又改善病人的营养状况。高F 值寡肽还具有提供能量、抗疲劳、改善手术后和卧床病人的蛋白营养状况、治疗苯丙酮尿症的作用，在医药与临床营养方面受到广泛关注。
酶解法制备的高F值寡肽混合液含有大量游离芳香族氨基酸，对寡肽液进行脱芳处理，才能提高寡肽的F值。目前常用的高F值化方法主要有吸附法和过滤分离法。国内高F值化处理主要采用活性炭吸附法，该方法成本低，非常适合工业化应用，但是活性炭对芳香族氨基酸的吸附不具有特异性，不仅可以脱除芳香族氨基酸，也会吸附包含支链氨基酸在内的其它氨基酸，难以达到理想的吸附效果，对F值的提升效果不理想且不稳定，对原料及酶解工艺要求较高。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，对吸附法脱芳处理进行了改进，制备了分子印迹聚合物作为芳香族氨基酸吸附剂，具体发明内容如下：
一种贝类高F值寡肽的制备方法，其步骤包括蛋白酶解、芳香族氨基酸专一吸附剂制备、芳香族氨基酸脱除，所述芳香族氨基酸专一吸附剂为分子印迹聚合物。
优选的，所述芳香族氨基酸脱除包括如下步骤：
向所述蛋白酶解后的产物中添加其1-5wt%分子印迹聚合物，10-20℃搅拌30-100min， 4000-10000r\/min离心5-30min，收集上清液，获得高F值寡肽溶液。
优选的，所述分子印迹聚合物由树枝化聚酰胺-胺制备而成。
进一步，所述分子印迹聚合物，其制备方法包括如下步骤：
(1)0.5代树枝状聚酰胺-胺制备：以乙二胺为核，进行Michael加成反应，制备0.5代树枝状聚酰胺-胺；
(2)1代树枝状聚酰胺-胺制备：以0.5代树枝状聚酰胺-胺和乙二胺进行酰胺化缩合反应制备1代树枝状聚酰胺-胺；
(3)2代树枝状聚酰胺-胺制备：对步骤(2)获得的1代树枝状聚酰胺-胺重复进行步骤(2)中的Michael加成和步骤(2)中的酰胺化缩合反应，制备2代树枝状聚酰胺-胺；
(4)端双键树枝状聚合物的制备： 由2代树枝状聚酰胺-胺和丙烯酰氯进行胺解反应即得到端双键树枝状聚酰胺-胺;
(5)分子印迹聚合物合成：以芳香族氨基酸作为模板，与步骤(4)中获得的端双键树枝状聚酰胺-胺合成，即得分子印迹聚合物。
再进一步，所述制备方法中步骤(1)的Michael加成反应，其工作条件为：将9份乙二胺和32 份甲醇加入到带有磁力搅拌子、回流冷凝管和温度计的三口烧瓶中,15-30℃ 通氮气5-20 min除氧，搅拌条件下，滴加103.2 份丙烯酸甲酯，反应10-30 h，在20-35 ℃,100-200 Pa的压力下减压蒸馏，除去溶剂甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得0.5代树枝状聚酰胺-胺；
所述制备方法中步骤(1)的酰胺化缩合反应，其工作条件为：将20.2 份 步骤(1)中获得的0.5代树枝状聚酰胺-胺和64 份甲醇混合，15-30℃ 搅拌条件下,滴加72 份乙二胺,反应10-30 h，在45-75℃,100-300 Pa 的压力下减压蒸馏,除去溶剂甲醇和乙二胺，得到1.0代树枝状聚酰胺-胺；
所述制备方法中步骤(4)的工作条件为：称取1份2代树枝状聚酰胺-胺和8-16份丙烯酰氯，用二氯甲烷溶解，通氮气保护，避光2-4℃反应1-3h，得到具有沉淀物的溶液，低温过滤，得到端双键树枝状聚酰胺-胺产物；
所述制备方法中步骤(5)的工作条件为：称取1份芳香族氨基酸作为模板分子，加入5 -10份乙醇，滴加50-200 µL 37wt%的盐酸使模板分子全部溶解；加入3-8 mmo1步骤(4)中获得的端双键树枝状聚酰胺-胺，溶解，于冰水浴中作用5-10h后加入功能单体与引发剂，超声混合均匀，充氮气3-15min，然后置于冰水浴中进行紫外光引发聚合；聚合完成后将所得产物粉碎、研磨，用甲醇和乙酸除去模板分子，真空干燥后备用；所述功能单体为甲基丙烯酸，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
再进一步，所述芳香族氨基酸为酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸。
优选的，所述蛋白酶解包括如下步骤：
(1)取新鲜贝肉洗净，按照贝肉与水的质量比1：5-1：10加水匀浆，得到浆料；
(2)向步骤(1)得到的浆料中加入内切蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为 占浆料总质量1000-3000U\/g，pH 5-8，酶解温度 30-50℃，酶解时间 5-10 h，然后煮沸5-15min灭酶，得到酶解液；
(3)向步骤(2)获得的酶解液中，加入外切蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量1000-2000U\/g，pH 5-8、酶解温度 30-55℃，酶解时间 8-12 h，然后煮沸5-15min灭酶。3000-8000r\/min离心5-30min，收集上清液，得到贝类寡肽溶液。
优选的，所述贝类为栉孔扇贝、虾夷扇贝或海湾扇贝。
优选的，所述高F值寡肽的F值为50以上。
以上所述份均为质量份数。
本发明的有益效果如下：
本发明以芳香族氨基酸为模板制备分子印迹聚合物，可实现对芳香族氨基酸的特异性精准吸附，有助于提高寡肽的F值，有效克服现有吸附剂吸附效果差、无特异性、损失大等缺点，实现了F值的快速提升，增加了高F值寡肽的产率，是对高F值寡肽制备工艺的有益改进；获得的高F值寡肽的F值为50以上，可广泛应用于医药、食品领域。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明实施例中使用的内切蛋白酶为复合蛋白酶Protemax，购买于诺维信(中国)生物技术有限公司，外切蛋白酶为风味蛋白酶，购买于南宁庞博生物工程有限公司。实施例中所述份均为质量份数。
高F值寡肽F值计算公式为：F= QUOTE 设计图
相关信息详情
申请码:申请号:CN201910634784.6
申请日:2019-07-15
公开号:CN110144377A
公开日:2019-08-20
国家:CN
国家/省市:37(山东)
授权编号:CN110144377B
授权时间:20191018
主分类号:C12P 21/06
专利分类号:C12P21/06;C07K1/14;C08F290/06;C08F220/06;C08F2/48;C08G73/02;C08J9/26;B01J20/26;B01J20/30
范畴分类:18H;
申请人:鲁东大学
第一申请人:鲁东大学
申请人地址:264025 山东省烟台市芝罘区红旗中路184号
发明人:赵芹;刘海梅;张满;温丑玉;徐瑞彬;张彩丽;李海燕;牛丽红;张莉莉;于慧
第一发明人:赵芹
当前权利人:鲁东大学
代理人:刘志毅
代理机构:37234
代理机构编号:烟台上禾知识产权代理事务所(普通合伙)
优先权:关键词:当前状态:审核中
类型名称:外观设计