E种肠道病毒HY12毒株的标签病毒拯救及5’-UTR对病毒复制的影响

论文摘要

牛肠道病毒（Bovine enteroviruses,BEV）是小RNA病毒科肠道病毒属中的成员,是引起牛临床上以消化道和呼吸道症状为主要特征传染病的病原体。尽管BEV致病性通常较低,感染后引起动物出现温和的临床症状,但是易与其他病原体发生混合感染和继发感染,常常导致牛群出现较高的死亡率,严重危害养牛业的健康发展。BEV感染为国内新发疫病,目前有关该病的发病机理及防控等众多问题仍不清楚,缺乏研究。2012年本实验室从国内某地牛群暴发的临床上以咳嗽、呼吸困难、严重腹泻为主要特征、发病率和致死率分别高达50%的疫病中分离鉴定出国内首株E种肠道病毒HY12。对HY12病毒的研究发现,该病毒5’-UTR二级结构与其他肠道病毒明显不同,且病毒的TCID50可达108-9/0.1m L,进而为该病毒作为活载体递送与表达外源抗原提供了潜在可能性。因此,为了探究HY12病毒基因组的外源序列潜在插入位点,以便为HY12表达外源抗原重组病毒的研究提供有效的技术方法与基础。本研究利用分子生物学、反向遗传学、病毒学和突变PCR等技术与方法,通过构建HY12病毒基因组的感染性c DNA克隆并对病毒进行拯救与鉴定,成功筛选、确定出适合表达外源序列的HY12病毒插入位点。同时,本研究应用反向遗传技术和突变PCR等技术方法,确定出影响HY12病毒复制的5’-UTR关键核苷酸。上述结果不仅为研究BEV的复制和致病机理打下理论基础,而且为研发基于人工突变弱化HY12病毒,进而以HY12为新型活载体疫苗的开发奠定基础。具体研究与结果如下:一、HY12-VP2蛋白单克隆抗体制备及抗原表位分析本研究以原核表达系统表达GST-VP2融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术获得了3株抗HY12-VP2蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibody,m Ab）,依次命名为3H4、1C2和1E10。通过Western blot实验发现,3株单克隆抗体均可与亲本HY12-VP2蛋白产生良好的免疫反应。过氧化物酶单层试验（IPMA）实验证实,3H4和1E10可与HY12感染的MDBK细胞呈阳性反应。此外,本研究以3H4和1E10为检测抗体,确定出HY12-VP2蛋白的亚细胞定位。在病毒感染2 h后,就可在细胞质中检测到VP2蛋白的表达,且表达在感染后16 h时仍然可检测到。对3株单抗的抗原表位鉴定显示,它们所针对的VP2表位不同,分别为152FQEAFWLEDG161（3H4）,168LIYPHQ173（1C2）和46DATSVD51（1E10）。通过与3株单抗针对的抗原表位的氨基酸序列进行比对,并对差异氨基酸进行表达,结果发现168LIYPHQ173在所有BEV毒株中完全保守;46DATSVD51在所有E种肠道病毒毒株中和部分F种肠道病毒毒株中高度保守;152FQEAFWLEDG161仅在E种肠道病毒毒株中保守。本研究成功制备的3株抗HY12-VP2蛋白的单克隆抗体,为后续重组VP2蛋白抗原的检测、HY12-VP2蛋白的亚细胞定位及BEV的鉴别诊断奠定基础。二、HA/Flag标签引入HY12病毒结构蛋白重组病毒的拯救及其生物学特性鉴定本研究利用突变PCR方法及反向遗传学技术成功将HA/Flag标签引入到HY12结构蛋白8个位点,构建出16个全长c DNA克隆,并成功拯救出3株重组标签病毒,分别命名为r HY12-VP4-N-HA、r HY12-VP4-N-Flag和r HY12-VP1-127HA。通过IPMA实验对其进行鉴定,结果显示r HY12-VP1-127HA病毒感染细胞后可与抗HY12-VP2 m Ab（3H4）和抗HA m Ab产生强阳性反应,而r HY12-VP4-N-HA和r HY12-VP4-N-Flag病毒感染细胞后与抗HA m Ab或抗Flag m Ab产生弱阳性反应。利用Western blot、免疫电镜、蚀斑实验和血清中和试验对r HY12-VP1-127HA标签病毒进行进一步生物学特性鉴定,结果显示该标签病毒成功表达HA蛋白,且病毒粒子直径、蚀斑大小及中和活性与r HY12亲本病毒相似。另外,共聚焦实验显示HA标签引入到VP1蛋白氨基酸127/128并没有明显影响标签病毒的复制周期。核酸序列测序分析显示,HA标签在重组标签病毒感染MDBK细胞中可稳定遗传15代之后。通过ICR乳鼠感染实验证实:重组标签病毒与r HY12亲本病毒感染均可引起小鼠脑、肺、肝和肠不同程度的病理变化;重组标签病毒与亲本病毒均可诱导小鼠产生抗HY12抗体,且标签病毒可诱导产生抗HA标签的抗体。上述结果为进一步深入研究病毒与宿主之间的相互作用及新型病毒活载体疫苗的开发奠定基础。三、HA标签引入HY12病毒非结构蛋重组病毒的拯救及其生物学特性鉴定为了进一步探究非结构蛋白是否可以引入外源基因的可能性,本研究利用上述分子生物学方法成功将HA标签引入到HY12非结构蛋白2A、2B和3A的6个位点,构建出6个全长c DNA克隆。然而,仅成功拯救出3株重组标签病毒,分别命名为r HY12-3A-2-HA、r HY12-3A-3-HA和r HY12-3A-9-HA。通过IPMA、Western blot方法进行鉴定,结果显示HA标签可在3株重组标签病毒中正确表达,且可与r HY12亲本病毒相区别。通过免疫电镜、病毒一步生长曲线、蚀斑实验及核酸序列分析显示,拯救的3株重组标签病毒与亲本病毒相比,具有相似的病毒粒子直径、蚀斑大小和生长特性。此外,HA标签在3株标签病毒感染MDBK细胞中可稳定遗传15代之后。利用拯救的3株重组标签病毒与亲本病毒分别感染3周龄ICR小鼠。结果显示,3株重组标签病毒与亲本病毒均可诱导小鼠产生抗HY12抗体,且3株标签病毒可诱导产生抗HA标签抗体。这些结果表明,BEV的非结构蛋白3A也可以作为表达外源基因的新靶点,为进一步研究病毒的复制机制、蛋白互作及载体疫苗的开发创造了新的技术平台。四、5’-UTR对HY12病毒复制的影响本研究采用突变PCR方法和反向遗传技术,通过突变5’-UTR的关键核苷酸,成功构建了38个5’-UTR突变体全长感染性c DNA克隆。通过将感染性克隆转染到BHK-21,发现同时突变5’-UTR 528/529位GG不能拯救出活病毒,表明这两个核苷酸位点对病毒复制起关键作用。对拯救出的38株5’-UTR突变体病毒与r HY12亲本病毒感染BHK-21细胞进行TCID50的测定,结果显示,5’-UTR的562位C突变为T影响病毒在BHK-21细胞上的复制。Western blot分析及蚀斑形态学观察进一步证实5’-UTR的562位C的突变显著性影响了病毒的复制。这些结果为今后深入揭示BEV的复制及致病机理研究奠定理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• abstract
• 英文缩写词表
• 引言
• 第一篇 文献综述
•   第1章 肠道病毒研究进展
•     1.1 肠道病毒形态结构与理化性质
•     1.2 肠道病毒及其分类
•     1.3 肠道病毒基因结构及功能
•       1.3.1 肠道病毒基因结构
•       1.3.2 肠道病毒的 5'-UTR和 3'-UTR结构和功能
•       1.3.3 肠道病毒编码的蛋白及其功能
•     1.4 肠道病毒感染的流行情况
•     1.5 肠道病毒感染与复制
•     1.6 肠道病毒致病机制
•   第2章 肠道病毒疫苗与载体疫苗
•     2.1 肠道病毒疫苗研究概况
•       2.1.1 EV-71 灭活疫苗
•       2.1.2 EV-71 病毒样颗粒（VLP）
•       2.1.3 EV-71 弱毒疫苗
•       2.1.4 EV-71 亚单位疫苗和合成肽疫苗
•       2.1.5 CV-A16灭活疫苗
•       2.1.6 CV-A16病毒样粒子（VLP）
•       2.1.7 EV-71/CV-A16二联疫苗
•       2.1.8 联合疫苗
•       2.1.9 脊髓灰质炎病毒（PV）灭活疫苗与弱毒疫苗
•     2.2 肠道病毒载体疫苗的研究进展
•   第3章 反向遗传学的研究
• 第二篇 研究内容
•   第1章 HY12-VP2蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定
•     1.1 材料
•       1.1.1 细胞、病毒、载体、试剂、实验动物
•       1.1.2 主要仪器
•     1.2 方法
•       1.2.1 HY12-VP2全长基因扩增与重组质粒构建
•       1.2.2 HY12-VP2蛋白的表达、纯化及鉴定
•       1.2.3 单抗制备
•       1.2.4 HY12-VP2蛋白单抗表位鉴定
•       1.2.5 亲本HY12-VP2亚细胞定位
•       1.2.6 单抗表位的保守性分析
•       1.2.7 单抗与不同BEV毒株相对应的表位区域交叉反应性分析
•     1.3 结果
•       1.3.1 重组VP2蛋白（GST-VP2）的表达
•       1.3.2 抗VP2单克隆抗体的产生及特性
•       1.3.3 单克隆抗体表位初步鉴定
•       1.3.4 HY12-VP2蛋白的亚细胞定位
•       1.3.5 单抗表位在不同BEV毒株中同源性分析
•     1.4 讨论
•     1.5 小结
•   第2章 HA/Flag标签引入HY12病毒结构蛋白重组病毒的拯救及其生物学特性鉴定
•     2.1 材料
•       2.1.1 细胞、病毒、载体、试剂、实验动物
•       2.1.2 主要仪器
•     2.2 方法
•       2.2.1 HY12毒株RNA的提取
•       2.2.2 重组标签病毒全长c DNA克隆构建
•       2.2.3 体外转染MDBK细胞
•       2.2.4 IPMA鉴定拯救的重组标签病毒
•       2.2.5 Western blot鉴定拯救的重组标签病毒
•       2.2.6 激光共聚焦
•       2.2.7 血清中和实验（SNA）
•       2.2.8 电镜观察拯救的病毒粒子
•       2.2.9 重组标签病毒一步生长曲线和形态学观察
•       2.2.10 重组标签病毒遗传稳定性
•       2.2.11 重组标签病毒与亲本病毒动物感染实验
•       2.2.12 病毒核酸检测
•       2.2.13 血清抗体检测
•       2.2.14 统计分析
•     2.3 结果
•       2.3.1 重组标签病毒全长c DNA克隆构建及其鉴定
•       2.3.2 重组标签病毒的拯救及其鉴定
•       2.3.3 rHY12-VP1-HA病毒在ICR乳鼠体内的生物学特性
•     2.4 讨论
•     2.5 小结
•   第3章 HA标签引入HY12病毒非结构蛋白重组病毒的拯救及其生物学特性鉴定
•     3.1 材料
•       3.1.1 细胞、病毒、载体、试剂、实验动物
•       3.1.2 主要仪器
•     3.2 方法
•       3.2.1 重组标签病毒全长c DNA克隆构建
•       3.2.2 体外转染MDBK细胞
•       3.2.3 IPMA鉴定拯救的重组标签病毒
•       3.2.4 Western blot鉴定拯救的重组标签病毒
•       3.2.5 激光共聚焦
•       3.2.6 电镜观察拯救的病毒粒子
•       3.2.7 重组标签病毒生长的一步曲线和蚀斑形态学观察
•       3.2.8 重组标签病毒遗传稳定性
•       3.2.9 重组标签病毒在不同细胞系感染性
•       3.2.10 重组标签病毒与亲本病毒动物感染实验
•       3.2.11 血清抗体检测
•       3.2.12 统计分析
•     3.3 结果
•       3.3.1 重组标签病毒全长c DNA克隆构建及其鉴定
•       3.3.2 重组标签病毒的拯救及其鉴定
•     3.4 讨论
•     3.5 小结
•   第4章 5'-UTR对HY12病毒复制的影响
•     4.1 材料
•       4.1.1 细胞、病毒、载体、试剂
•       4.1.2 主要仪器
•     4.2 方法
•       4.2.1 突变体病毒全长c DNA克隆构建
•       4.2.2 体外转染BHK-21 细胞
•       4.2.3 突变体病毒不同时间点的TCID50测定
•       4.2.4 突变体病毒Western blot鉴定
•       4.2.5 突变体病毒蚀斑实验
•       4.2.6 突变体病毒二级结构预测
•       4.2.7 统计分析
•     4.3 结果
•       4.3.1 突变体病毒全长c DNA克隆构建
•       4.3.2 突变体病毒不同时间点TCID50测定
•       4.3.3 突变体病毒Western blot鉴定
•       4.3.4 突变体病毒蚀斑形态
•       4.3.5 突变体病毒二级结构预测
•     4.4 讨论
•     4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 导师简介
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘丹

导师: 王新平

关键词: 种肠道病毒,蛋白,单克隆抗体,重组标签病毒,感染性克隆,生物学特性鉴定,病毒复制

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林大学

基金: 国家自然科学基金项目(31572531),国家十三五重大研发项目(2017YFD0500194,2016YFD0500904)

分类号: S852.65

总页数: 137

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