剧毒鹅膏等温扩增检测及鹅膏毒素基因多样性研究

论文摘要

误食野生蘑菇中毒事件近年来在我国频频发生,已成为我国食物中毒事件中导致死亡的最主要因素,并且80%以上的蘑菇中毒死亡都是由剧毒的鹅膏菌所引起。中毒后蘑菇种类的早期鉴定对于中毒诊断和治疗具有非常重要的作用,然而,由于鹅膏菌物种的多样性以及往往中毒现场样本的不完整性,形态鉴定又需要专业分类工作者,同时,目前的分子生物学鉴定需要PCR仪和DNA测序,所需时间长,难以满足基层疾控和医疗单位对毒蘑菇中毒后需要快速鉴定毒源的要求。此外,目前剧毒鹅膏等含鹅膏毒素物种的转录组信息数据不足,相关毒素基因家族研究也正成为研究热点,还有更多新的环肽基因及其编码的肽类物质有待发现。本文从剧毒鹅膏等温扩增检测方法的建立、剧毒鹅膏等子实体的de novo转录组测序、鹅膏毒素基因及脯氨酰寡肽酶基因（POP）的多样性等方面展开了研究,主要结果如下:1.基于环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,以内转录间隔区（ITS）作为靶序列,针对欧美的双孢鹅膏Amanita bisporigera、绿盖鹅膏A.phalloides以及我国的致命鹅膏A.exitialis、灰花纹鹅膏A.fuliginea等10种剧毒鹅膏的各物种,设计了10组特异性LAMP引物,建立了相应的物种特异性检测方法;同时为了能够区分识别剧毒鹅膏和非剧毒鹅膏,设计了一组通用LAMP引物,建立了剧毒鹅膏的通用检测方法。本文对LAMP反应体系和条件（镁离子浓度、反应温度、时间等）进行了优化,结合HNB染色法对扩增产物进行检测,并对引物的特异性和灵敏度进行了评估。结果表明62°C恒温扩增1 h就能得到反应结果;LAMP的DNA分子检出限达10 pg;特异性引物可以区分剧毒鹅膏中不同分支（clade）的鹅膏种类,但是不能很好地区分同一分支内的鹅膏种类;通用引物能特异地检测剧毒鹅膏,并可以有效区分剧毒鹅膏和非剧毒鹅膏。2.基于超分支滚环扩增技术（hyperbranched rolling circle amplification,HRCA）,以ITS作为靶序列,针对双孢鹅膏A.bisporigera等10种剧毒鹅膏的各物种,设计了10种特异性锁式探针（padlock probe,PLP）,建立了相应的物种特异性检测方法;以α-鹅膏毒肽基因（α-AMA）设计了通用PLP、通用PCR引物,建立了剧毒鹅膏的通用检测方法。本文对HRCA的连接、扩增体系和条件进行优化（PLP浓度、连接时间等）,结合SYBR Green I染色法对扩增产物进行检测,并对探针、PCR引物的特异性和灵敏度进行了评估。结果表明60°C或65°C恒温连接1 h,然后62°C恒温扩增1 h就能得到反应结果;每一物种特异性探针可以专一地识别不同的剧毒鹅膏,无交叉反应出现;通用探针、PCR引物能检测出所有剧毒鹅膏,并将其与非剧毒鹅膏以及含鹅膏毒素的盔孢伞（Galerina）、环柄菇（Lepiota）区分开来;HRCA的DNA分子检出限达1 pg,α-AMA重组质粒的检出限为100拷贝,蘑菇混合物污染检出限为0.2%,表明HRCA的灵敏度是LAMP的10倍,是常规PCR的100倍。3.通过转录组数据分析,兼并引物或特异性引物PCR扩增,从10种鹅膏菌、2种盔孢伞以及1种环柄菇中获取MSDIN基因和POP基因序列,结果如下:共获得151条MSDIN基因,编码98种不同环肽,包括α-amanitin（α-AMA）、β-amanitin（β-AMA）、phallacidin（PHA）和phalloidin（PHD）和94种未知环肽;盔孢伞和环柄菇只含编码α-AMA的MSDIN基因;同时共获得10条POPA,9条POPB,鹅膏属、盔孢伞属和环柄菇属剧毒种均含有2类POP,为POPA和POPB,而不含鹅膏毒素的欧式鹅膏则只含POPA。4.对α-AMA和POP结构进行分析,结果表明:鹅膏菌、盔孢伞、环柄菇α-AMA前体肽分别以MSDIN、MFDTN、MDAN开头;鹅膏菌、盔孢伞α-AMA含3个内含子,而环柄菇α-AMA含2或3个内含子;POPA均含18个内含子,POPB则均含17个内含子。5.基于鹅膏毒素基因和POP的ML系统发育分析表明,盔孢伞和环柄菇α-AMA,鹅膏菌α-、β-AMA,PHA,PHD,分别聚类形成四个分支;鹅膏菌POPA,盔孢伞POPA,环柄菇POPA,鹅膏菌、盔孢伞和环柄菇POPB,分别聚类形成四个分支。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 鹅膏菌的分类和中毒概述
•     1.1.1 剧毒鹅膏菌在鹅膏属中的分类地位
•     1.1.2 剧毒鹅膏菌的种类及其中毒情况
•   1.2 鹅膏肽类毒素的研究概况
•     1.2.1 鹅膏肽类毒素的种类和结构
•     1.2.2 鹅膏肽类毒素的检测方法
•     1.2.3 鹅膏肽类毒素的中毒症状和机制
•   1.3 鹅膏毒素基因及生物合成
•     1.3.1 鹅膏毒素基因的发现
•     1.3.2 鹅膏毒素基因的分布和多样性
•     1.3.3 鹅膏毒素的生物合成
•   1.4 .环介导等温扩增技术的研究进展
•     1.4.1 LAMP反应的原理
•     1.4.2 LAMP的特点
•     1.4.3 LAMP产物的检测方法
•     1.4.4 LAMP的应用
•   1.5 滚环扩增技术的研究进展
•     1.5.1 锁式探针结合滚环扩增的反应原理
•     1.5.2 滚环扩增的特点
•     1.5.3 滚环扩增产物的检测方法
•     1.5.4 滚环扩增的应用
•   1.6 本研究的目的与意义
• 第二章 基于环介导等温扩增技术检测剧毒鹅膏方法的建立和评估
•   2.1 引言
•   2.2 材料和方法
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 实验药品和试剂
•     2.2.3 实验仪器和设备
•     2.2.4 实验方法
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 LAMP检测体系的建立和优化
•     2.3.2 特异性LAMP引物的特异性检测
•     2.3.3 通用LAMP引物的特异性检测
•     2.3.4 LAMP灵敏度
•   2.4 讨论
• 第三章 基于超分支滚环扩增技术检测剧毒鹅膏方法的建立和评估
•   3.1 引言
•   3.2 材料和方法
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 试剂和药品
•     3.2.3 主要仪器
•     3.2.4 实验方法
•   3.3 结果和分析
•     3.3.1 HRCA体系的建立和优化
•     3.3.2 特异性HRCA探针的特异性检测
•     3.3.3 通用HRCA探针和通用PCR引物的特异性检测
•     3.3.4 锁式探针的容错检测
•     3.3.5 HRCA和 PCR的灵敏度检测
•   3.4 讨论
• 第四章 鹅膏毒素基因和脯氨酰寡肽酶基因的多样性及系统发育分析
•   4.1 引言
•   4.2 材料和方法
•     4.2.1 蘑菇样品的采集和处理
•     4.2.2 核酸提取和cDNA的制备
•     4.2.3 cDNA文库的构建和高通量测序
•     4.2.4 数据过滤与De novo组装
•     4.2.5 MSDIN家族基因及POP基因的检索和注释
•     4.2.6 鹅膏毒素基因与POP基因的克隆
•     4.2.7 鹅膏毒素基因和POP基因的系统发育树构建
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 转录组的数据过滤和组装
•     4.3.2 MSDIN基因和POP基因的挖掘
•     4.3.3 MSDIN基因的比对
•     4.3.4 鹅膏毒素基因和POP基因的结构
•     4.3.5 鹅膏毒素基因和POP基因的系统发育分析
•   4.4 讨论
• 第五章 结论与展望
•   5.1 研究结论
•   5.2 特色与创新之处
•   5.3 展望
• 参考文献
• 博士期间论文发表情况
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 何正蜜

导师: 陈作红

关键词: 鹅膏菌,环介导等温扩增,超分支滚环扩增,鹅膏毒素基因,脯氨酰寡肽酶基因,盔孢伞

来源: 湖南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 湖南师范大学

分类号: Q949.32

总页数: 138

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