一、Fv-4基因杂合子小鼠对Fr.MuLV感染的敏感性差异的分析（论文文献综述）
陈沛[1]（2021）在《FoxO1在大口黑鲈糖脂代谢中的机制研究》文中研究指明配合饲料中淀粉过高容易引起大口黑鲈（Micropterus salmoides）代谢性肝病（MLD）,而过低不利于膨化浮性饲料的加工。提高配方中淀粉含量不仅可以降低饲料成本,同时也可以提高饲料的质量。因此,提高大口黑鲈对淀粉利用是其产业可持续发展的核心问题。在哺乳动物中,FoxO1是调控肝脏糖异生,增强糖耐量和胰岛素敏感性的关键分子位点。因此,本研究主要探讨FoxO1在大口黑鲈糖脂代谢中的作用机制,旨在阐明大口黑鲈糖不耐受的原因,提高其对淀粉的利用能力。试验1:高淀粉饲料对大口黑鲈营养代谢的研究用淀粉水平为9.06%（LS）和13.56%（HS）的等氮等脂饲料饲养大口黑鲈（初始体重为47.60±0.20g）8w,研究HS对大口黑鲈生长性能、糖脂代谢及能量代谢的影响。结果表明,2w时,HS对大口黑鲈SGR没有显着性影响（P>0.05）,而8w后,SGR显着性下降（P<0.05）。无论在2w或8w,HS和LS组餐后24h血浆葡萄糖显着低于3h,而胰岛素却没有显着差异。在2w,HS组鱼肝体比,血浆AKP和TBA水平,肝糖原、TG、TC、TBA和NEFA含量均显着升高（P<0.05）,且肝脏糖酵解、糖异生、脂合成、胆汁酸合成、能量代谢、炎症和凋亡相关基因表达显着上调（P<0.05）,而脂解和抗氧化显着下调（P<0.05）。在2w,HS组出现肝脏核致密化和纤维化的表型,且肝病组AKT-FoxO1磷酸化显着被抑制（P<0.05）,而FoxO1蛋白和转录水平显着上调（P<0.05）。然而8w,HS组所有鱼的代谢指标均恢复稳态,FoxO1蛋白及转录水平也没有显着差异（P>0.05）,甚至肝脏未见明显异常。因此,由于胰岛素分泌不足,大口黑鲈摄食HS后,下调AKT-FoxO1磷酸化水平导致糖异生升高和TG蓄积,引起急性糖脂代谢紊乱,诱导MLD;然而大口黑鲈长期通过提高胆汁酸合成和能量代谢来进行“自我修复”,并对高淀粉产生适应性与FoxO1的稳态有关。试验2:大口黑鲈FoxO1基因克隆、组织表达及功能研究大口黑鲈FoxO1的氨基酸序列具有非常保守的叉头结构域、反式激活结构域和AKT磷酸化位点。进化树分析表明大口黑鲈FoxO1与硬骨鱼聚一类,且与鲈形目最相似。FoxO1 m RNA在脑和肝脏中表达高,而在肌肉中表达低。激活FoxO1-S267和S329位点的磷酸化会导致FoxO1从细胞核向细胞质转运,磷酸化的FoxO1在胞质中水解失活,从而下调FoxO1表达水平。试验3:大口黑鲈注射葡萄糖或胰岛素-葡萄糖对糖代谢影响通过腹腔注射0.75%生理盐水（10 m L/kg鱼体重）、葡萄糖（1 g/kg鱼体重）或胰岛素-葡萄糖（1.35 U牛胰岛素+1g葡萄糖/kg鱼体重）来研究AKT-FoxO1通路在糖代谢中的作用。结果表明:葡萄糖负荷导致持续高血糖,而血浆胰岛素水平却没有显着差异（P>0.05）。注射胰岛素-葡萄糖后,胰岛素水平明显升高（P<0.05）,血浆葡萄糖6h后恢复到正常水平,说明持续高血糖是胰岛素分泌不足所致。在3h时,与葡萄糖注射组相比,胰岛素-葡萄糖注射组肝脏AKT-FoxO1磷酸化被显着激活（P<0.05）,糖酵解GK和PK酶活也显着上升（P<0.05）,而糖异生PCK和G6Pase却显着降低（P<0.05）。因此,胰岛素通过激活AKT-FoxO1磷酸化提高糖酵解和降低糖异生水平,来应对餐后高血糖应激,从而提高大口黑鲈糖耐受。试验4:FoxO1在大口黑鲈糖脂代谢中机制研究用5.5 m M葡萄糖（Control）、25 m M葡萄糖（HG）和25 m M葡萄糖+1μM FoxO1抑制剂AS1842856处理大口黑鲈原代肝细胞,结果发现HG也引起肝细胞糖脂代谢的紊乱,主要表现为糖异生升高和TG蓄积;AS1842856抑制FoxO1表达,可以改善HG诱导肝细胞糖脂代谢的紊乱。通过双荧光酶素报告系统试验表明FoxO1能正调控pck和chrebp启动子,负调控srebp1启动子。综上所述,高淀粉饲料通过AKT-FoxO1-PCK和AKT-FoxO1-Chrebp/Srebp1通路分别介导糖异生和脂代谢,导致糖脂代谢紊乱,从而诱导代谢性肝病发生,是大口黑鲈糖淀粉利用能力差的主要原因。
童萍[2]（2021）在《基于GAT-2探讨抑郁症肝郁脾虚证及逍遥散干预机制》文中研究指明抑郁症是世界范围内第四大致残疾病,具有高患病率、高复发率、高自杀死亡率、高致残率和症状高度异质的特点,而诊疗过程缺乏特异性,治愈率低。预计,到2030年抑郁症将成为全球疾病负担的主要原因。随着精神医学的发展,抑郁症在机制及诊疗方面的研究有了长足的进步,但仍只有不到三分之一的患者在首次药物治疗中获益。究其原因可能与抑郁症机制不明、诊疗缺乏个体化等有关。因此,完善抑郁症的病理机制研究、寻找个体化和精准化的治疗方案具有重要的意义。γ-氨基丁酸能系统可能参与了抑郁症的发病,但目前的研究大多集中在其代谢或受体功能方面的研究,对于其转运体的研究鲜有涉及。海马神经元可塑性在抑郁症发病机制中的作用引起了越来越多的关注,认为海马神经元可塑性的降低导致海马结构和功能受损是抑郁症的主要病理特征。中医关于证型的研究为实现个体化、精准医疗提高了可能。中医临床研究发现抑郁症的主要中医证型为:肝郁脾虚证、心脾两虚证、气滞血瘀证、肝郁气滞证、心肾不交证和肝郁痰阻证,其中肝郁脾虚证的出现频率最高。近年来,医学界对肝郁脾虚证从神经、内分泌、免疫等方面进行了多系统、多层次和多指标的研究,有关抑郁症肝郁脾虚证的研究不多。逍遥散具有疏肝解郁、理气养血、健脾和胃等作用,研究发现逍遥散对多系统多种疾病的肝郁脾虚证临床疗效显着,也可通过保护与促进海马元生长、改善海马结构和功能而达到抗抑郁的作用,其治疗机制可能是多靶点、多层次的,涉及海马神经元可塑性的研究较少。建立具有表面效度、结构效度和预测效度的疾病动物模型是科学有效研究疾病的保证,目前抑郁症肝郁脾虚证的造模方法存在诸多不足。“环境与遗传”共同作用的理论更符合疾病的发病机制,即应激与脆弱的生理功能协同作用导致抑郁症肝郁脾虚证,而目前有关研究少有,尤其涉及γ-氨基丁酸转运体2的动物模型研究国内外尚未见报道。为探索γ-氨基丁酸转运体2在抑郁症中医证型发病机制中的影响,本课题组以γ-氨基丁酸转运体2基因（s1c6a13）敲除小鼠（KO）作为研究对象,与同源C57BL6野生型（WT）比较分析其生理特征以及应激造模的效果;以西酞普兰作为阳性对照药物,以在体和离体实验研究了逍遥散的治疗效果和机制;以健康体检者和抑郁症其它中医证型患者为对照,探索抑郁症肝郁脾虚证患者血浆特征性指标的意义。主要包括以下五部分研究内容:第一部分 s1c6a13基因对小鼠行为和生理功能的影响目的:探索γ-氨基丁酸转运体2基因（s1c6a13）敲除（KO）小鼠与野生型（WT）小鼠在表观行为、脑源性神经营养因子（BDNF）及其前体、血浆单胺类神经递质、海马神经元PI3k/Akt/mTOR及海马神经元突触可塑性方面的差异,初步了解s1c6a13基因对小鼠的影响。方法:同源KO和WT小鼠各10只,雌雄各半,观察比较其在旷场实验（OFT）、蔗糖偏好实验（SPT）、悬尾实验（TST）、强迫游泳实验（FST）、摄食量和自我理毛行为活动中的表现;ELISA法检测两组小鼠外周血浆中BDNF、Pro-BDNF、5-HT、DA和NE浓度;IHC法定性分析目标蛋白在海马组织中的表达情况;qPCR法检测目标蛋白mRNA表达的差异。结果:与WT小鼠相比,KO小鼠在OFT、SPT、TST、FST、摄食量和自我理毛行为表观行为上差异无统计学意义（P>0.05）;KO小鼠血浆BDNF、pro-BDNF、5-HT、DA和NE浓度与WT小鼠相比差异无统计学意义（P>0.05）;海马神经元PI3k/Akt/mTOR信号通路指标,KO小鼠的Akt的表达低于WT小鼠（P=0.03）,两组小鼠的PI3k和mTOR的表达差异无统计学意义（P>0.05）;KO小鼠的MAP-2和SYP的表达低于WT小鼠（P=0.03）,而GAP-43的表达高于WT小鼠（P=0.03）。结论:s1c6a13基因敲除小鼠在表观行为、血浆神经营养因子及其前体、血浆单胺类神经递质上与野生型小鼠无明显差异,但却存在海马神经元PI3k/Akt/mTOR信号通路的蛋白表达和突触可塑性相关蛋白表达的影响,而这种影响可能是其生理脆弱性的表现。第二部分抑郁症肝郁脾虚证slc6MaD-/-小鼠模型的建立与评价目的:建立并评价slc6a13-/-小鼠造抑郁症肝郁脾虚证疾病模型的效果。方法:以WT小鼠为对照,对s1c6a13-/-小鼠施以慢性应激,分别从OFT、SPT、TST、FWT、摄食量和自我理毛行为方面评估模型效果,并分析模型小鼠血浆外周血浆中BDNF、Pro-BDNF、5-HT、DA和NE浓度的变化,以及造模对小鼠海马神经元P13k/Akt/mTOR信号通路指标及神经可塑性指标MAP-2、GAP-43和SYP表达的影响。结果:造模结束时,在OFT中,KO-D组总路程明显低于WT-C和WT-D组（P<0.01）,WT-D和KO-D组活跃度均明显低于WT-C组（P<0.01）,WT-D和KO-D组中央区时间均明显低于WT-C组（P<0.01）;在SPT中,WT-D（P<0.05）和KO-D（P<0.01）组蔗糖偏好均明显低于WT-C组;在TST中,KO-D组悬尾不动时间明显高于WT-C组（P<0.05）,在FST中,WT-D和KO-D组强迫游泳不动时间均明显高于WT-C组（P<0.01）;WT-D和KO-D组体重均明显低于WT-C组（P<0.01）,WT-D和KO-D组日摄食量均明显低于WT-C组（P<0.05）,WT-D和（P<0.05）KO-D（P<0.01）组理毛时间均明显低于WT-C组。造模后7天时,在OFT中,KO-D组总路程明显低于WT-C（P<0.05）和WT-D组（P<0.01）,WT-D 和 KO-D 组活跃度均明显低于WT-C组（P<0.05）,KO-D组中央区时间明显低于WT-C（P<0.01）和WT-D组（P<0.05）;在SPT中,KO-D组蔗糖偏好明显低于WT-C和WT-D组（P<0.01）;在TST中,KO-D组悬尾不动时间明显高于WT-C组（P<0.05）;在FST中,KO-D组强迫游泳不动时间明显高于WT-C和WT-D组（P<0.01）;WT-D和KO-D组体重均明显低于WT-C组（P<0.01）,KO-D组日摄食量均明显低于WT-C和WT-D组（P<0.01）,KO-D组理毛时间均明显低于WT-C和WT-D组（P<0.05）。KO-D 组血浆 pro-BDNF 均明显低于WT-C和WT-D组（P<0.01）,WT-D和KO-D组 PI3k 的mRNA均明显低于WT-C组（P<0.01）,WT-D（P<0.05）和KO-D（P<0.01）组Akt的mRNA均明显低于WT-C组,WT-D和KO-D组mTOR的mRNA均明显低于WT-C组（P<0.01）,WT-D和KO-D组MAP-2的mRNA 均明显低于WT-C组（P<0.01）,KO-D组GAP-43的mRNA 均明显高于 WT-C（P<0.01）和WT-D（P<0.05）组,WT-D和KO-D组SYP的mRNA均明显低于WT-C组（P<0.01）。结论:slc6a13-/-小鼠造抑郁症肝郁脾虚证的疾病模型更稳定可靠,是较好的慢性应激造抑郁症肝郁脾虚证的模型;KO小鼠海马神经元PI3K/AKT/mTOR信号通路中蛋白及可塑性相关指标的变化程度更大,提示这些变化可能与疾病发生的病理机制有关。第三部分逍遥散对s1c6a13-/-抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠的作用及机制研究目的:研究逍遥散干预抑郁症肝郁脾虚证小鼠模型的效果及机制。方法:slc6a13-/-抑郁症肝郁脾虚证小鼠模型为研究对象,氢溴酸西酞普兰为阳性对照药,比较分析不同浓度逍遥散的效果。分别从抑郁和肝郁脾虚的特征性行为、外周血浆指标方面评估治疗效果,并从PI3k/Akt/mTOR信号通路和海马神经突触可塑性角度探索其机制。结果:灌胃7d时,OFT中,CH、XS-M和XS-H组总路程均明显高于PW组（P<0.01）,表现为XS-H组活跃度明显高于PW组（P<0.05）,CH、XS-L、XS-M和XS-H组中央区时间均明显高于PW组（P<0.01）;在SPT中,XS-M和XS-H组蔗糖偏好均明显高于PW组（P<0.01）,在TST中,XS-H组悬尾不动时间明显低于PW组（P<0.05）。灌胃14d时,在OFT中,CH、XS-M和XS-H组总路程均明显高于PW组（P<0.01）,CH、XS-M（P<0.05）和XS-H组（P<0.01）活跃度均明显高于PW组,CH、XS-M和XS-H组中央区时间均明显高于PW组（P<0.01）;在SPT中,CH、XS-M和XS-H组蔗糖偏好均明显高于PW组（P<0.01）;在TST中,CH、XS-M和XS-L组悬尾不动时间明显低于PW组（P<0.05）;CH、XS-M和XS-H组强迫游泳不动时间均明显低于PW组（P<0.01）;XS-H组体重显着高于PW组（P<0.05）,CH和XS-H组摄食量均显着高于PW组（P<0.01）;CH、XS-M和XS-H组理毛时间均显着高于PW组（P<0.01）。CH、XS-L、XS-M 和 XS-H 组血浆 BDNF 均显着高于PW组（P<0.01）,XS-M和XS-H 组血浆 pro-BDNF 浓度均显着高于 PW 组（P<0.01）;CH（P<0.01）和 XS-H（P<0.05）组MAP-2的表达均明显高于PW组,CH（P<0.05）和XS-H（P<0.01）组SYP的表达均明显高于PW组。结论:高浓度逍遥散与氢溴酸西酞普兰效果一致,可改善抑郁症肝郁脾虚证小鼠模型的表观行为,氢溴酸西酞普兰、低/中/高浓度逍遥散均显着提高了小鼠血浆BDNF浓度,中/高浓度逍遥散显着提高了血浆pro-BDNF浓度,高浓度逍遥散和氢溴酸西酞普兰的效果一样,增加了海马神经元突触可塑性相关蛋白MAP-2和SYP的表达,对GAP-43并没有出现类似的效果。第四部分逍遥散含药血清干预抑郁症肝郁脾虚证小鼠海马神经元的效果研究目的:研究逍遥散含药血清对抑郁症肝郁脾虚证小鼠海马神经元体外培养的效果。方法:以第二部分的方法造模成功后分离培养模型小鼠海马神经元,分别以纯水组（PW）、氢溴酸西酞普兰组（CH）和逍遥散组（XS）分别制备的血清进行培养,免疫荧光鉴定海马神经元生长状况,Western Blot检测PI3k/Akt/mTOR信号通路和海马神经突触可塑性相关蛋白的表达情况。结果:PW血清培养导致KO-D组PI3k的蛋白表达显着高于WT-C（P<0.01）和KO-C组（P<0.01）,CH血清培养导致WT-C和KO-D组PI3k的蛋白表达显着高于KO-C组（P<0.01）,XS血清培养导致KO-C和KO-D组PI3k的蛋白表达显着高于WT-C组（P<0.01）。PW血清培养导致Akt蛋白表达显着高于WT-C（P<0.05）和KO-D组（P<0.01）,CH血清培养导致KO-C组PI3k的蛋白表达显着低于WT-C（P<0.01）和KO-D组（P<0.01）,XS血清培养导致KO-C和KO-D组PI3k的蛋白表达显着高于WT-C组（P<0.01）。CH血清培养导致KO-D组mTOR蛋白表达显着高于WT-C（P<0.05）和KO-C组（P<0.01）,XS血清培养导致KO-C（P<0.05）和KO-D（P<0.01）组mTOR蛋白表达显着高于WT-C组。PW血清培养导致WT-C和KO-C组MAP-2蛋白表达显着高于KO-D组（P<0.01）,CH血清培养导致WT-C和KO-C组MAP-2蛋白表达显着高于KO-D组（P<0.01）,WT-C组显着高于KO-D组（P<0.01）,XS血清培养导致WT-C和KO-C组MAP-2蛋白表达显着高于KO-D组（P<0.01）。PW血清培养导致WT-C和KO-C组GAP-43蛋白表达显着低于KO-D组（P<0.01）,CH血清培养导致WT-C和KO-C组GAP-43蛋白表达显着低于KO-D组（P<0.01）,KO-C组显着低于WT-C组（P<0.01）,XS血清培养导致WT-C和KO-C组GAP-43蛋白表达显着低于KO-D组（P<0.01）PW血清培养导致WT-C和KO-C组SYP蛋白表达显着高于KO-D组（P<0.01）,KO-C组显着高于WT-C组（P<0.05）,CH血清培养导致WT-C和KO-C组SYP蛋白表达显着高于KO-D组（P<0.01）,KO-C组显着高于WT-C组（P<0.05）,XS血清培养导致WT-C和KO-C组SYP蛋白表达显着高于KO-D组（P<0.01）,KO-C组显着高于 WT-C 组（P<0.01）。结论:CS能显着降低slc6a13-/-抑郁症肝郁脾虚证小鼠MAP-2和SYP的相对表达,而GAP-43的表达则相反;逍遥散含药血清和氢溴酸西酞普兰含药血清可增加抑郁症肝郁脾虚证小鼠海马神经元PI3k、Akt和mTOR蛋白的相对表达;逍遥散含药血清和氢溴酸西酞普兰含药血清可增加抑郁症肝郁脾虚证小鼠海马神经元MAP-2和SYP的相对表达,但在增加SYP表达方面,逍遥散含药血清的作用弱于氢溴酸西酞普兰含药血清。逍遥散含药血清和氢溴酸西酞普兰含药血清均能降低抑郁症肝郁脾虚证小鼠海马神经元GAP-43的相对表达。第五部分抑郁症肝郁脾虚证血液指标及GAT-2mRNA的价值目的:探索抑郁症肝郁脾虚证患者外周血中特性指标及GAT-2mRNA的诊疗价值。方法:运用ELISA法、生化检测和q-PCR法检测血浆中BDNF、pro-BDNF、5-HT、DA、NE、GAB3A、GAD65 和 GAD67、GLU 浓度和 SLC6A13mRNA 的表达。结果:三组被试性别组成（χ2=0.95,P=0.10）和年龄组间（F=1.52,P=0.23）,差异无统计学意义,HAMD得分的组间差异有统计学意义（F=53.33,P=0.00）,表现为D-OS和D-LSSD组得分均显着高于HC组（P<0.01）,而D-OS和D-LSSD组间差异无统计学意义（P>0.05）;BDNF血浆浓度组间差异有统计学意义（F=168.76,P=0.00）,表现为D-OS和D-LSSD组的血浆BDNF浓度均显着低于HC组（P<0.01）,D-LSSD组显着低于D-OS组（P<0.01）;por-BDNF血浆浓度组间差异有统计学意义（F=21.35,P=0.00）,表现为D-OS和D-LSSD组的血浆pro-BDNF浓度均显着低于HC组（P<0.01）,D-OS组和D-LSSD组之间差异无统计学意义（P>0.05）;5-HT血浆浓度组间差异有统计学意义（F=195.07,P=0.00）,表现为D-OS和D-LSSD组的血浆5-HT浓度均显着低于HC组（P<0.01）,D-LSSD组显着低于D-OS组（P<0.01）;DA血浆浓度组间差异有统计学意义（F=353.07,P=0.00）,表现为D-OS和D-LSSD组的血浆DA浓度均显着低于HC组（P<0.01）,D-LSSD组显着低于D-OS组（P<0.01）;NE血浆浓度组间差异有统计学意义（F=108.76,P=0.00）,表现为D-OS和D-LSSD组的血浆NE浓度均显着低于HC组（P<0.01）,D-LSSD组显着低于D-OS组（P<0.01）;Glu血浆浓度组间差异有统计学意义（F=4.20,P=0.00）,表现为D-OS和D-LSSD组的血浆Glu浓度均显着低于HC组（P<0.01）,D-LSSD组显着低于D-OS组（P<0.01）;GABA血浆浓度组间差异有统计学意义（F=62.32,P=0.00）,表现为D-OS和D-LSSD组的血浆GABA浓度均显着高于HC组（P<0.01）,D-LSSD组显着高于D-OS组（P<0.01）;GAD65血浆浓度组间差异有统计学意义（F=222.34,P=0.00）,表现为D-OS和D-LSSD组的血浆GAD65浓度均显着高于HC组（P<0.01）,D-LSSD组显着高于D-OS组（P<0.01）;GAD67血浆浓度组间差异无统计学意义（F=0.34,P=0.71）;SLC6A13mRNA血浆相对表达组间差异有统计学意义（F=191.47,P=0.00）,表现为D-OS和D-LSSD组的血浆SLC6A13mRNA表达量均显着低于HC组（P<0.01）,D-LSSD组显着低于D-OS组（P<0.01）;以抑郁症其它中医证型患者和抑郁症肝郁脾虚证患者血浆样本中SLC6A13mRNA 相对表达量的 ROC 曲线下面积（area under the curve,AUC）:0.97;Cut-off值:29.06;敏感度:96.7%;特异性:90.0%;约登指数:86.7%。结论:血浆BDNF、单胺类神经递质、Glu、GABA和GAD65可能是抑郁症肝郁脾虚证的敏感性指标,而SLC6A13mRNA则是其特征性指标。
张静[3]（2020）在《人SP-B基因1580C/T多态性与铜绿假单胞菌肺炎致肺损伤易感性的研究》文中研究表明研究背景肺表面活性蛋白B（SP-B）是由Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的一种疏水蛋白,在降低肺泡表面张力和宿主防御方面起着重要的作用。SP-B在肺表面活性物质功能中起重要作用,而且与肺部疾病相关。SP-B缺乏的小鼠在出生时死于严重急性呼吸衰竭。人SP-B基因有数个多态性基因位点,其中重要的单核苷酸多态性（SNP rs1130866,即SP-B 1580 C/T）,该多态性形成两种常见的遗传等位基因,SP-B C和T等位基因,C等位基因有额外的N-连接糖基化位点而T等位基因没有,这种糖基化位点的不同可能影响SP-B蛋白在某些疾病或压力状态下的加工和功能,该多态性具有不同的维持呼吸稳态能力和宿主防御功能。研究表明SP-B 1580C/T基因多态性与肺部疾病有关。SP-B基因1580位点携带C等位基因的成年以及儿童患者更容易受到严重的肺损伤。铜绿假单胞菌肺炎是一种ICU常见的革兰氏阴性菌感染,可直接引起肺损伤,严重者可引起脓毒症甚至可危及生命,导致死亡率较高。人SP-B基因1580C/T多态性对铜绿假单胞菌肺炎尤其是重症肺炎的易感性研究较少,其相关机制研究更少。转人类基因（hTG）小鼠模型为人类基因多态研究扩展了更多可能性,可研究人类基因复杂的病理生理过程,是人类疾病研究的有利工具。本研究采用hTG SP-B 1580C/T小鼠建立铜绿假单胞菌肺炎模型,研究其不同等位基因的易感性差异并探讨相关机制。研究目的1.建立hTG SP-B 1580C/T小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型,监测小鼠体内细菌变化,在组织学及分子水平上分析组织损伤及炎性水平;2.研究铜绿假单胞菌肺炎hTG小鼠的肺SP-B变化,NF-κB/NLRP3信号通路及细胞死亡;3.研究人SP-B 1580C/T小鼠不同等位基因的易感性差异并探讨相关机制。研究方法一、转人SP-B基因小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型的建立及肺损伤的观察1.选取8-12周鼠龄,体重25g左右的转人类SP-B基因小鼠（FVB/N系背景）以及FVB/N野生型WT小鼠,对所有小鼠剪尾提取DNA进行PCR基因鉴定,根据PCR结果将小鼠分为三组SP-B-T组、SP-B-C组、WT组。每组小鼠再随机分为2组:肺炎组（Pneumonia组）以及对照组（Control组）。2.将表达生物荧光的铜绿假单胞菌Xen5菌株进行细菌培养,分光光度法测定菌液的浓度,并接种在琼脂板培养基隔夜培养进行菌落计数以确定菌液浓度。将菌液用无菌生理盐水稀释500倍,肺炎组的小鼠每只经气管内注入50μl稀释的菌液（每只小鼠约4 ×104 CFU）,对照组每只小鼠经气管内注入50μl无菌生理盐水。肺炎模型建立后,定期观察小鼠的一般情况,并定期进行体内荧光活体成像,监测铜绿假单胞菌在小鼠体内的生长状况,观察肺炎模型小鼠的生存状况,计算该肺炎模型小鼠的死亡率指标。3.建模24小时后,麻醉处死各组小鼠,留取新鲜血液,肺泡灌洗液（BALF）及新鲜肺组织。取新鲜稀释的BALF液进行琼脂板培养基接种细菌培养,观察BALF中的细菌菌落计数。光学显微镜下计数肺泡灌洗液中的细胞总数,并将BALF甩片经HEMA3染色后观察巨噬细胞和中性粒细胞分类情况。新鲜肺组织经10%福尔马林固定24小时后,进行石蜡包埋切片HE染色,观察肺组织病理变化并进行肺组织损伤评分,以评估肺损伤的严重程度。应用透射电子显微镜观察肺组织在细胞水平的病理变化。4.将肺组织用PBS液充分匀浆,高速离心后,收集上清液并用BCA方法测定总蛋白浓度,Western Blot法测定各组肺组织中SP-B蛋白表达水平。测定BALF中总蛋白浓度,并用Western Blot法测定各组BALF中SP-B蛋白表达水平。免疫荧光法观察各组肺组织SP-B表达水平,并比较各组SP-B的差异。5.将新鲜BALF高速二次离心后提取大聚体（LAs）,应用约束液滴表面光度法（constrained drop surfactometry,CDS）测定表面张力。37℃和相对湿度接近100%下,以每秒20循环的速度压缩和膨胀吸附的表面活性剂膜,以模拟正常的潮汐呼吸。采用闭环轴称滴形分析法（closed-loop axisymmetric drop shape analysis,CL-ADSA）同时测定表面活性剂膜的表面张力和表面积。用动态循环期间的最小表面张力（γmin）作为表面活性的指标。二、人SP-B基因1580C/T多态性对肺炎模型的易感性差异及潜在机制6.用免疫荧光法及Western Blot法观察肺组织pNF-κB的表达,同时应用ELISA方法测定血清、肺组织匀浆液及BALF中炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平,比较该模型下各组小鼠炎性水平的差异。7.用TUNEL方法观察各组小鼠肺组织凋亡细胞情况并比较其差异。Western Blot法测定各组肺组织中凋亡相关蛋白Bcl-2,cleaved caspase-3的表达水平并比较各组间的差异,以观察该模型中细胞凋亡情况。8.用免疫荧光方法观察各组小鼠肺组织pMLKL表达情况并比较其差异。Western Blot法测定各组肺组织中坏死性凋亡相关蛋白RIP3,MLKL,pMLKL的表达水平并比较各组间的差异,以观察该模型中细胞坏死性凋亡情况。9.用免疫荧光方法观察各组小鼠肺组织NLRP3表达情况并比较其差异。Western Blot 法测定各组肺组织中NLRP3,ASC,cleaved caspase-1,GSDMD的表达水平并比较各组间的差异,以观察该模型中细胞焦亡情况。10.统计学方法:结果以平均值±SEM的形式表示。本研究采用SigmaStat统计学软件进行统计学处理,并应用GraphPad Prism绘图软件进行作图。数据经检验符合正态分布,两组之间采用独立样本Student’s t检验,三组小鼠之间的比较是通过单因素方差分析进行分析。生存率的比较使用Kaplan-Meier生存曲线并通过Log-rank检验进行统计学分析。当P<0.05时,考虑各组之间有统计学差异,当P<0.01时认为统计学差异非常显着。结果一、转人SP-B基因小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型的建立及肺损伤的观察1.PCR基因分型鉴定结果显示hTG小鼠表达人SP-B C或T等位基因,但不表达小鼠SP-B基因,WT小鼠仅表达mSP-B基因。Western Blot和免疫荧光观察正常hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠的肺组织中SP-B的表达,结果显示,hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠的肺中均正常表达SP-B。此外,Western半定量分析表明,hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠肺中的SP-B水平相当。2.建模后三种小鼠对照组精神状态好,饮食及活动正常;而肺炎组小鼠精神萎靡不佳,饮食量明显减少,行动迟缓。IVIS-200活体成像系统动态监测小鼠体内细菌荧光成像,结果显示感染后小鼠体内大量细菌生长。感染12小时后三种类型小鼠体内细菌都急剧增加;与SP-B-T和WT小鼠相比,SP-B-C小鼠的细菌负荷水平在感染后24、36和48小时都最高。感染后SP-B-C小鼠48小时的死亡率高于SP-B-T和WT小鼠,对照组小鼠均没有死亡,表明三种类型的小鼠对该铜绿假单菌肺炎存在敏感性差异。3.感染24小时后,感染小鼠与对照组相比BALF中的总细胞数显着增加,且SP-B-C小鼠的总细胞数在三类感染小鼠中最高。显微镜下观察到对照组的BALF中仅有巨噬细胞,而感染小鼠的BALF中90%以上的细胞是嗜中性粒细胞。感染后BALF中巨噬细胞较对照组增加,三种小鼠间巨噬细胞无差异。感染后BALF嗜中性粒细胞较对照组增加,三种小鼠中SP-B-C小鼠嗜中性粒细胞数目最高。感染小鼠的BALF有大量细菌生长,而对照组小鼠BALF未培养出细菌,肺炎感染组SP-B-C小鼠肺中细菌CFU数在三种小鼠中最高。4.肺组织切片HE染色显示,与对照组相比,感染小鼠出现明显的肺损伤,肺泡内及肺间质中可见大量炎性细胞聚集,并可见大量蛋白质碎片堆积,以及肺泡壁增厚。肺损伤评分显示三种类型感染小鼠的评分均显着高于各个对照组,感染SP-B-C小鼠的损伤评分高于感染SP-B-T及WT小鼠。5.透射电子显微镜观察到各对照组小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞内有许多正常的板层小体以及线粒体结构,而感染后的小鼠在电镜下可观察到自噬小体数目增加,板层小体结构受损,线粒体异常,以及Ⅱ型肺泡细胞中微绒毛数量减少。6.免疫荧光结果显示,感染后SP-B表达下降,每个高倍镜视野下SP-B表达阳性的细胞数SP-B-C小鼠明显低于SP-B-T和WT小鼠。Western Blot结果显示,三种小鼠的肺组织以及BALF中SP-B表达也显示出相似的趋势。Western半定量分析表明,各种类小鼠之间肺组织和BALF中SP-B表达的存在显着差异,三种类型的感染小鼠中SP-B-C小鼠的SP-B表达最低。7.小鼠BALF中肺表面活性物质（主要指大聚体LAs）表面张力测定结果显示,与对照组小鼠相比,肺炎组小鼠的最小表面张力（γmin）显着增高,提示感染后小鼠肺表面活性功能明显受损。三类小鼠的对照组的γmin无差别,而肺炎组的γmin有显着差异,SP-B-C>SP-B-T>WT,表明在感染条件下,hSP-B基因多态对肺泡表面张力的调节存在差异。二、人SP-B 1580C/T基因多态性对肺炎模型的易感性差异及潜在机制8.应用免疫荧光和Western Blot分析方法检查了肺组织中NF-κB炎性信号通路中活化的pNF-κB蛋白的表达。免疫荧光显示,对照组小鼠无pNF-κB蛋白的表达,肺炎组小鼠pNF-κB表达显着增高。pNF-κB表达阳性的细胞数统计分析显示,hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠肺炎组pNF-κB表达均比对照组明显升高,有统计学差异,与受感染的SP-B-T及WT小鼠相比,感染的SP-B-C小鼠的pNF-κB蛋白水平最高。Western Blot结果显示同样的趋势,感染后hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠pNF-κB表达显着增高,与受感染的SP-B-T及WT小鼠相比,感染的SP-B-C小鼠的pNF-κB/NF-κB 比例最高,差别有统计学意义。9.ELISA方法测定结果显示,感染后三种小鼠的血清、肺组织匀浆液及BALF中炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平均较对照组显着增高,感染后SP-B-C小鼠细胞因子水平明显高于感染后的SP-B-T及WT小鼠,有显着性差异。10.用TUNEL方法分析感染小鼠肺细胞凋亡情况,感染24小时后,三种类型小鼠均可见大量的凋亡细胞,而对照组小鼠则未见凋亡细胞。TUNEL 阳性细胞的定量分析表明,感染的SP-B-C小鼠的凋亡细胞数量显着高于感染的SP-B-T和WT小鼠。Western Blot结果显示,感染后三种类型小鼠肺内Bcl-2水平低于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的Bcl-2水平低于SP-B-T和WT小鼠。感染后三种类型小鼠肺内cleaved caspase-3水平高于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的cleaved caspase-3水平高于SP-B-T和WT小鼠。这些结果表明铜绿假单胞菌感染后小鼠肺内发生细胞凋亡,且SP-B-C小鼠的凋亡更严重。11.免疫荧光显示感染小鼠的肺内pMLKL高表达,而对照组小鼠中未见表达,提示存在细胞坏死性凋亡。pMLKL阳性细胞的定量分析显示,肺炎组SP-B-C 小鼠中pMLKL阳性细胞数量明显高于SP-B-T和WT小鼠。Western blot结果显示,感染后三种类型小鼠肺内RIP3水平低于对照组,SP-B-C小鼠的RIP3水平低于WT小鼠。感染后MLKL和pMLKL的表达增加,SP-B-C小鼠的MLKL和pMLKL水平高于SP-B-T和WT小鼠。这些结果表明铜绿假单胞菌感染后小鼠肺内发生坏死性凋亡,且SP-B-C小鼠的坏死性凋亡更严重。12.应用免疫荧光和Western Blot分析方法检查了肺组织中NLRP3和焦亡相关蛋白的表达。免疫荧光显示感染小鼠的肺内NLRP3大量激活,而对照组小鼠中未见激活。NLRP3阳性细胞的定量分析显示,感染的SP-B-C小鼠中NLRP3阳性细胞数量显着高于感染的SP-B-T和WT小鼠,而SP-B-T小鼠高于WT小鼠。Western blot结果显示,感染后三种类型小鼠肺内NLRP3水平高于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的NLRP3水平高于SP-B-T和WT小鼠。感染后ASC和cleaved caspase-1的表达增加,SP-B-C小鼠的水平高于SP-B-T小鼠。三种类型的小鼠中,肺炎组小鼠的肺内GSDMD水平高于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的GSDMD水平高于SP-B-T小鼠和WT小鼠。这些结果表明铜绿假单胞菌感染后小鼠肺内发生焦亡,且SP-B-C小鼠的焦亡更严重。结论在铜绿假单胞菌肺炎模型中,感染后转人基因SP-B 1580C/T小鼠体内细菌大量生长,出现严重的肺损伤,大量炎性细胞及高死亡率,肺内SP-B蛋白水平明显降低,肺表面活性物质表面张力明显升高,小鼠体内NF-κB及NLRP3信号通路激活,炎性细胞因子水平增加,出现细胞凋亡,坏死性凋亡和焦亡等细胞死亡类型,SP-B-C小鼠较SP-B-T小鼠表现出更高的易感性,炎性损伤更重,更多的细胞死亡。提示SP-B 1580C/T多态可通过调节NF-κB及NLRP3通路及细胞死亡发挥对肺炎致ARDS的易感性调控作用。
尧丽[4]（2020）在《习得性无助动物模型的改进及其多巴胺机制研究》文中指出习得性无助（Learned helplessness）是指不可控应激引起个体在可逃避情境中的逃避缺陷,最早由Seligman在1967年研究狗的行为时提出,并随之发展形成了习得性无助理论:个体习得了对环境事件的不可控性,产生对环境不可控的预期,从而在将来的情境中表现出无助。然而,在习得性无助现象研究五十周年之际,Maier和Seligman系统回顾了习得性无助理论和研究,提出经典习得性无助模型中动物的无助不是“习得”的,而是对应激的先天适应性反应。事实上,狗在经历不可控应激前,具有丰富的控制经历,而实验室饲养的动物并没有类似的控制经历。因此,以没有任何控制经验的实验室小鼠为对象研究习得性无助现象时,需要突出环境从可控到不可控过程的转变,才能更准确的模拟人类反复经历控制丧失、社会挫败后的情绪和行为异常。多巴胺系统参与强化学习过程,其异常活动与情绪行为障碍,如抑郁的发生关系密切,这提示习得性无助行为可能与多巴胺神经元异常活动有关。本研究以C57BL/6小鼠为研究对象,采用三组共轭设计,建立了丧失控制（Loss of control,LOC）的小鼠模型——一个通过习得控制到丧失控制产生无助的动物模型,并结合在体电生理、离体电生理和光纤记录手段,探讨了 SNc脑区多巴胺神经元参与调节丧失控制导致情绪和行为异常的神经机制。本论文的主要内容和结果如下:（1）丧失控制导致更严重的逃避缺陷本研究将C57BL/6小鼠随机分为3组:丧失控制组（LOC）、共轭组（L-Yoked）和对照组（No shock,NS）,LOC组小鼠首先进行3天负强化学习获得控制,然后进行3天消退学习丧失控制;L-Yoked组小鼠共轭接受与LOC组完全相同的电击,但完全受LOC组控制,对照组仅适应环境,然后进行穿梭箱测试。结果发现:相比于L-Yoked组,LOC组小鼠表现出更严重的逃避缺陷,说明电击本身导致小鼠表现逃避缺陷,而丧失控制导致小鼠产生更严重的逃避缺陷。为了探讨获得控制和不完全丧失控制对小鼠逃避行为的影响,首先增加了无消退学习的设计,分别是连续进行3天和6天负强化学习获得对电击控制的ES3和ES6组及其共轭组（E-Yoked3和E-Yoked6）,然后进行穿梭箱测试。结果发现:共轭组小鼠表现出显着的逃避缺陷,而ES3和ES6组表现出正常的逃避行为,说明获得控制的保护效应,避免或减轻电击本身的伤害。其次,增加了1天消退学习的设计,分别是经历3天负强化学习后进行1天消退学习的ES/IS组及其共轭组（EI-Yoked）,结果发现:共轭组表现出逃避缺陷,而ES/IS组表现出正常的逃避行为,说明电击本身对小鼠的伤害,而先前控制电击经历避免或减轻不可控电击的伤害。这些结果证明,习得控制到完全丧失控制产生的心理应激是导致小鼠产生更严重的无助行为的关键。（2）控制和丧失控制不调节小鼠的应激反应为了探讨LOC模型制备过程中和测试时小鼠的应激反应,分别测定模型制备第1、4、6天以及第7天穿梭箱测试后小鼠的血清皮质酮水平。结果发现:模型制备第1天,Learning组和Learning-Yoked组小鼠皮质酮水平均显着升高;模型制备第4天,ES/IS组比EI-Yoked和NS组小鼠血清皮质酮水平显着升高;模型制备第6天,三组无显着差异;然而在第7天穿梭箱测试后,三组小鼠皮质酮水平没有显着差异,且均显着高于没有经历穿梭箱测试的NS组。这些结果说明,控制和丧失控制不调节小鼠对电击的应激反应,提示丧失控制导致小鼠产生更严重的逃避缺陷并非由简单的生理应激反应引起,而可能是受高级的神经中枢调节。（3）丧失控制导致SNc脑区多巴胺神经元基础活动水平增强,对奖赏诱发的反应性减小为了探讨丧失控制对小鼠SNc脑区多巴胺神经元的基础活动和内在生理特性的影响,分别观测了模型制备后小鼠SNc脑区多巴胺神经元的自发活动和内在兴奋性。结果发现:LOC组小鼠的多巴胺神经元的平均放电频率、爆发式放电频率以及不同电流注入诱发的动作电位个数均显着增加,说明丧失控制导致小鼠SNc脑区多巴胺神经元基础活动增强。为了探讨丧失控制对自然奖赏诱发的多巴胺神经元反应的影响,观测了模型制备前后糖水摄入时多巴胺神经元的荧光信号变化。结果发现:模型制备后,LOC组小鼠在糖水摄入时的荧光信号显着降低,L-Yoked组和NS组无显着变化,说明丧失控制导致SNc脑区多巴胺神经元对自然奖赏的反应性减小。（4）多巴胺动态编码负强化学习过程为了观测负强化学习过程中SNc脑区多巴胺神经元活动的动态变化,同步记录了小鼠负强化学习时的钙信号变化。结果发现:Learning组在负强化学习过程中,当电击首次出现时,多巴胺神经元活动增加;随着电击重复的出现,多巴胺神经元活动减弱。在电击结束时,多巴胺神经元活动增强。当小鼠还未学会通过触碰鼻触关闭电击时,多巴胺神经元活动减弱。然而,随着小鼠学会关闭电击,此时多巴胺神经元活动增强。这些结果说明,电刺激的新颖性引起SNc多巴胺神经元活动增强,而其本身的负性价值引起SNc多巴胺神经元活动减弱。一旦经过负强化学习后,电刺激成为预测厌恶刺激即将结束的条件信号,引起多巴胺神经元活动增强。综上所述,电击本身导致小鼠产生被动行为,丧失对电击的控制导致小鼠产生更严重的无助和抑郁样行为,而控制电击的经历避免或减轻电击本身以及随后不可控应激的伤害。本研究建立了一个适用于实验室饲养小鼠的习得性无助模型,证明了从习得控制到完全丧失控制产生的心理应激才是小鼠经历不可控应激后产生无助和抑郁样行为的关键。控制和丧失控制不调节小鼠对电击的应激反应。其可能的发生机制是:控制调节SNc脑区多巴胺神经元的活动,丧失控制导致小鼠SNc脑区多巴胺神经元基础活动水平增加,对奖赏诱发的反应性减小,从而表现出一系列的抑郁样行为。
向青青[5]（2020）在《慢性肉芽肿病记忆B细胞数量变化机制及常染色体显性遗传高IgE综合征临床、分子特征研究》文中研究表明第一部分慢性肉芽肿病通过滤泡辅助T细胞调节记忆B细胞数量变化的研究目的:慢性肉芽肿病（Chronic granulomatous disease,CGD）是一类少见的吞噬细胞的呼吸爆发功能障碍的原发性免疫缺陷病（Primary immunodeficiency disease,PID）。本研究以CGD患者和gp91phoxKO小鼠为模型,探讨CGD中记忆B细胞（Memory B cells,MBC）数量变化及其可能的机制。方法:收集15例CGD患者的临床资料,流式细胞术检测CGD患者及健康同龄对照的外周血B细胞各亚群和滤泡辅助性T淋巴细胞（T follicular helper T cells,Tfh）的百分比,Tfh亚群变化,以及Tfh细胞表面的可诱导性共刺激分子（Inducible co-stimulator,ICOS）、程序性细胞死亡受体1（Programmed cell death 1,PD-1）分子、CD40配体（CD40ligand,CD40L）等分子的表达量。鉴定gp91phoxKO小鼠模型并对其免疫功能进行评估。T细胞依赖性抗原NP-KLH免疫小鼠后流式细胞术检测gp91phoxKO和WT小鼠脾脏中B细胞各亚群的百分比和Tfh细胞以及其相关功能分子ICOS、PD-1等的表达。结果:CGD患者外周血初始B（Na?ve B）细胞的百分比与健康对照组比明显升高,MBC百分比、类别转换MBC百分比以及浆细胞（Plasma cells,PC）的百分比与健康对照组比明显降低。CGD患者外周血Tfh的比例与健康对照组比明显降低,Tfh亚群Tfhl7的百分比显着高于健康对照组,Tfh1和Tfh2的百分比与健康对照组无明显差异。CGD患者Tfh细胞表面的CD40L较对照组明显降低,Tfh表面的ICOS以及PD-1分子比例与健康对照组无明显差异,B细胞表面CD40与健康对照组无明显差异。gp91phoxKO小鼠呼吸爆发功能障碍,与病人相符。gp91phoxKO小鼠未免疫状态脾脏中B细胞各亚群和Tfh细胞的百分比较WT小鼠无明显差异。T细胞依赖性抗原NP-KLH一次及二次免疫小鼠后,gp91phoxKO小鼠脾脏增大,但生发中心B细胞（GCB）,抗原特异性GCB细胞,类别转换MBC,PC和Tfh细胞较WT小鼠均无明显差异。结论:CGD患者Na?ve B细胞向MBC和PC分化过程存在障碍。Tfh细胞数量及其表面的CD40L表达的减少,可能与MBC减少有关。gp91phoxKO小鼠呼吸爆发功能障碍与病人一致,但对TD-Ag应答反应正常,与病人MBC减少不一致,提示gp91phox KO小鼠NP-KLH免疫后应答机制与病人体内应答机制不一致。第二部分常染色体显性遗传高IgE综合征的临床表现及分子特征目的:STAT3基因突变导致的常染色体显性遗传高IgE综合征（Autosomal dominant Hyper-IgE syndrome,AD-HIES）是一种罕见的PID。本研究分析20例STAT3基因突变导致的AD-HIES临床特征、分子特点和Th17细胞数量变化。方法:总结2009年1月-2018年12月在重庆医科大学附属儿童医院收治的20例AD-HIES患者的临床资料,分析患者及其家属的STAT3基因,检测外周血中的Th17细胞数量。结果:20例患者男性有14例,女性有6例,平均起病年龄为0.12岁,平均诊断年龄为5.31岁。20例（100%）患者NIH评分均大于40分。最常见的表现是湿疹（100%,20/20）、肺炎（95%,19/20）、皮肤冷脓肿（85%,17/20）和慢性皮肤粘膜念珠菌病（70%,14/20）。肺炎中金黄色葡萄球菌（40%,6/15）是主要的病原菌。10例（50%,10/20）患者发展成肺大疱,其中3例接受了部分肺叶切除术以治疗肺大疱。卡介苗接种并发症7例（38.8%,7/18）。20例（100%,20/20）患者均有增高的血清IgE水平（757.4-38900 IU/ml）和嗜酸性粒细胞数量（510-4180 cells/μL）。与正常对照相比,AD-HIES患者外周血Th l7细胞比例明显减少。共鉴定出11种STAT3杂合子突变,其中2个未被报道（C712G;c.1139+5G>T）。3例患者（15%,3/20）死亡。9例（45%,9/20）在预防性地使用抗生素和抗真菌药物预防感染,4例（20%,4/20）坚持使用IVIG。结论:对于自幼出现湿疹,反复出现的皮肤冷脓肿、金黄色葡萄球菌肺炎、真菌感染,嗜酸性粒细胞增多和血清IgE水平增高时,需要警惕AD-HIES。在这项研究中,我们的病人起病年龄以及诊断年龄较早,卡介苗并发症的发生率较高,死亡率也较高。终身预防性使用磺胺甲恶唑和伊曲康唑可减少感染。
贺今[6]（2019）在《芳香烃受体介导NLRP3炎症小体信号通路在苯致造血损伤中的作用机制研究及逆转对策》文中指出研究目的苯（C6H6）作为芳香烃毒物,既是油漆、喷漆、制鞋、制药和粘胶等行业中常用的有机溶剂,也是汽车尾气排放、室内装修和香烟烟雾中常见的环境污染物,因此职业暴露人群及普通人群均有机会接触苯,导致慢性苯中毒。慢性苯中毒所引起的血液系统损伤主要表现为白细胞减少和血小板减少,严重者可引起再生障碍性贫血/骨髓造血衰竭（Bone marrow failure,BMF）以及急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）。BMF主要表现为骨髓造血抑制引起的三系细胞减少,其毒性机制主要为苯及其代谢物如氢醌、苯酚在骨髓蓄积引起的造血干/祖细胞毒性,但其具体分子机制尚未完全阐明。流行病学研究表明苯中毒患者引起的AML通常发生于BMF之后,因此苯诱导的AML（Benzene-induced AML,BZ-AML）作为继发性白血病,具有与原发性白血病不同的机制特点,对其发病机制的研究有助于BZ-AML预防及治疗。炎症小体是一类分布于胞浆中的蛋白复合体。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3,NLRP3）是目前研究最广泛及最具有特征性的炎症小体之一,在接受到内源性危险信号如ROS刺激后可活化并诱导免疫和炎性反应,因此在免疫防御及氧化应激方面具有重要意义。目前研究已经表明苯可引起ROS的过度生成,而ROS是NLRP3炎症小体的内源性激活物。那么,NLRP3炎症小体是否在苯诱导的氧化应激损伤中发挥作用?NLRP3炎症小体的活化与机体T淋巴细胞免疫功能损伤有无关联?通过调控与苯诱导的骨髓毒性相关的哪些分子通路发挥作用?在苯诱导的BMF和AML不同造血损伤中NLRP3的表达有无异同?现在尚不清楚。苯作为芳香烃毒物,主要与胞浆内的芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor,AhR）结合,AhR是一种存在于胞浆中的配体激活的转录因子,苯作为外源性配体与胞浆中AhR结合后使其受到活化而进入细胞核中,进而启动目标基因的表达。目前研究证实AhR基因敲除小鼠在苯染毒暴露后不再引起骨髓造血毒性,表明AhR是苯诱导骨髓造血毒性的重要胞浆转录因子。目前认为苯诱导的造血毒性的主要机制有两点:1、苯与骨髓细胞浆内的AhR结合后直接作用于造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）引起细胞周期、基因调控、凋亡及氧化应激的异常,从而引起HSC的增殖期和静止期平衡异常;2、苯的代谢物如苯醌、氢醌与骨髓细胞的AhR结合后引起的细胞毒性反应。因此,AhR在苯的造血毒性机制中具有重要作用,但其具体分子调控机制尚不清楚。目前建立的苯诱导的造血损伤动物模型,在不同的种系、苯暴露剂量和途径及时间均进行了实验性研究,然而尚欠缺可完全复制的苯诱导的BMF、AML动物模型。我们在总结既往动物模型建立研究基础上,优化了苯暴露途径、剂量、时间,分别应用不同苯暴露的方案建立了拟人化的BMF和AML小鼠模型。在建模基础上,进一步明确苯与AhR结合后能否激活NLRP3炎症小体,及NLRP3异常表达在苯诱导骨髓细胞氧化损伤中的作用。此外,分别利用淫羊藿多糖（Epimedium polysaccharides,EPS）对苯诱导的 BMF 及鸦胆子苦醇（Brusatol）对苯诱导的AML进行药物治疗干预,进一步验证NLRP3的异常表达在苯诱导的BMF和AML不同造血毒性中的作用。为明确AhR介导的NLRP3炎症小体异常活化在苯诱导的造血毒性中的作用及EPS、Brusatol的临床应用提供了体内实验依据。本论文从以下两个方面进行了研究:一、AhR介导NLRP3信号传导通路在苯致BMF中作用机制研究及逆转对策:在成功采用皮下注射苯的方法建立苯诱导的BMF小鼠模型基础上,本研究结果表明骨髓细胞中AhR及NLRP3炎症小体基因及蛋白表达均明显增高,表明AhR及NLRP3炎症小体的异常活化与骨髓造血衰竭密切相关;应用EPS能通过抗凋亡、抑制氧化应激、增强T淋巴细胞免疫功能及调节造血因子紊乱机制发挥改善骨髓造血衰竭的作用。二、AhR介导NLRP3信号传导通路在BZ-AML中作用机制研究及逆转对策:在成功采用吸入苯的方法建立BZ-AML小鼠模型基础上,本研究结果表明骨髓单个核细胞的NRF2及NLRP3炎症小体的异常活化与苯的致白血病作用密切相关,Brusatol通过抑制骨髓单个核细胞NRF2、NLRP3的基因及蛋白表达及诱导凋亡发挥抗白血病作用。研究方法一、AhR介导NLRP3信号传导通路在苯致BMF中作用机制研究及逆转对策1.50只CD1雄性小鼠分为建模组和对照组。建模组40只,分为4个亚组（10只/组）:BMF组、EH组、EL组、CsA组,背部皮下注射苯油混合物,对照组（Control组）10只背部皮下注射等量玉米油,每周注射3次（周一、三、五）,直至累计完成25次注射剂量。实验期间,观察小鼠一般状态并记录体重的变化。2.利用剪尾取血法采集外周血,兽用血细胞计数仪检测白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板（PLT）计数以及网织红细胞（RC）百分比、血红蛋白（Hgb）浓度的变化;利用HE染色观察外周血涂片、骨髓细胞学涂片及股骨病理学改变,通过与对照组比较,验证苯诱导的BMF小鼠的成模率。3.设计AhR、CYP1A1特异性引物,骨髓细胞经裂红及离心后获得骨髓单个核细胞（Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs）,利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测AhR及CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠肝脏和BMMNCs中的差异表达。4.利用流式细胞仪检测BMMNCs中ROS的生成及外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞的百分比,qPCR和Western blot方法检测NLRP3的表达,研究NLRP3炎症小体异常表达在苯诱导的氧化应激损伤及免疫毒性中的意义。5.利用流式细胞仪检测BMMNCs的细胞周期、细胞凋亡率,Western blot方法检测D1型细胞周期蛋白（CyclinD1）、细胞周期蛋白依赖性激酶K4（Cyclin-dependent kinases K4,CDK4）蛋白的表达水平,研究细胞周期及细胞凋亡率的异常在苯诱导的BMF发病机制中的意义。6.建模成功后,给予 EH 组（EPS100mg/kg）、EL 组（EPS20mg/kg）、CsA 组（CsA1Omg/kg）小鼠采用灌胃给药治疗4周,BMF组及对照组给予等量生理盐水灌胃。每天灌胃1次,连续4周。通过观察各组小鼠体重变化,兽用血细胞分析仪检测小鼠血常规变化,显微镜观察外周血细胞涂片、骨髓细胞涂片、股骨病理学变化,观察EPS对苯诱导的BMF的治疗作用。7.为明确EPS对苯诱导的BMF的治疗作用机制,本研究进一步利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs的细胞凋亡率的变化,通过qPCR方法观察BMMNCs 凋亡相关基因 Caspase-9、BCL-2、BAX 的表达,进一步 Western blot方法检测BAX蛋白的表达,观察EPS对凋亡的影响及机制。8.为明确EPS是否通过调控细胞周期发挥治疗作用,本研究利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs的细胞周期的变化,通过qPCR及Western blot方法检测BMMNC中CDK4基因和蛋白的表达,观察EPS对于细胞周期的影响。9.为明确EPS是否通过调控免疫及造血因子发挥治疗作用,本研究利用流式细胞仪及ELISA方法,检测各组小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群变化,以及外周血造血调控因子IL-2、IL-11和EPO浓度的变化,观察EPS对于T细胞亚群及细胞因子的影响。10.为明确EPS是否通过调节BMMNCs的氧化应激损伤发挥作用,本研究利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs中ROS水平变化,进一步qPCR检测BMMNCs中NLRP3炎症小体基因表达变化,观察EPS对于氧化应激损伤的影响。二、AhR介导NLRP3信号传导通路在BZ-AML中作用机制研究及逆转对策1.将30只雄性CBA/Ca小鼠随机分为3组（10只/组）:对照组、BZ-AML组、Brusatol组。对照组（Control组）小鼠吸入空气,BZ-AML组、Brusatol组小鼠通过静式染毒柜吸入苯:苯浓度300ppm,每天6小时（6h/d）,每周5天（5d/w）,连续8周。实验期间,观察小鼠一般状态并记录体重的变化。2.通过血常规、外周血涂片、骨髓细胞学涂片及股骨病理学检查以及流式细胞仪检测CD34+、CD45+、CD13+、CD19+髓性白血病免疫分型,通过与对照组比较,验证BZ-AML小鼠的成模。3.流式细胞仪检测BZ-AML小鼠BMMNCs中的ROS生成及外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+T 淋巴细胞的百分比。4.利用SPE-GC-MS检测BZ-AML小鼠血液、肝脏、肾脏、骨髓不同脏器苯及其代谢产物苯酚、氢醌等的浓度,分析了苯及其代谢物在不同脏器的分布在BZ-AML发病机制中的意义。5.利用流式细胞仪检测BZ-AML小鼠BMMNCs的细胞凋亡率及细胞周期的改变,分析凋亡和周期异常在其发病机制中的意义。6.利用免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）及 Western blot 检测 BZ-AML小鼠骨髓组织及BMMNCs的NLRP3的表达,Western blot检测BZ-AML小鼠BMMNCs中AhR及CYP1A1的表达,观察AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML发病机制中的意义。7.确认建模成功后,Brusatol用无菌注射用水稀释后,Brusatol组给予腹腔注射Brusatol 4mg/kg,对照组及BZ-AML组均给予腹腔注射等体积的无菌注射用水,每天注射1次,5天/疗程,连续两个疗程。治疗结束后,Western blot检测 BZ-AML 小鼠 BMMNCs 的 AhR、CYP1A1、NRF2、CDK4、CyclinDl、NLRP3等的表达变化,进一步验证AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML中的调控机制。研究结果一、AhR介导的NLRP3信号通路在苯致BMF中作用机制及EPS逆转策略1.建立苯诱导的BMF小鼠模型首先我们利用CD1小鼠皮下注射苯（2mL/kg）的方法建立BMF小鼠模型。血常规结果显示,BMF模型组与对照组比较WBC、RBC、PLT计数、RC百分比及Hgb浓度明显下降;血涂片及骨髓细胞学涂片显示有核细胞均明显减少;股骨组织病理学检查显示骨髓增生度极度低下,造血面积明显减少。结果表明小鼠模型与人类苯诱导的BMF具有相似的造血损伤特征。2.AhR、CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠肝脏和骨髓中的差异性表达为了明确AhR和CYP1A1在苯诱导的造血毒性中作用,本研究首先检测了苯蓄积的主要靶器官肝脏和骨髓中AhR和CYP1A1的表达。qPCR方法检测基因表达和Western blot方法检测蛋白表达结果显示,与对照组相比,BMF组小鼠AhR和CYP1A1在骨髓和肝脏表达均明显升高,而在骨髓细胞的表达增高较肝脏更为显着。3.苯诱导BMF小鼠模型BMMNCs的ROS增高及NLRP3炎症小体活化为了研究NLRP3在苯诱导的骨髓毒性中的作用,本研究在成功建立BMF模型基础上,首先应用流式细胞仪检测了 BMMNCs的ROS生成,明确苯暴露是否诱导小鼠骨髓氧化应激损伤。发现与对照组相比,BMF模型组小鼠BMMNCs的ROS产生明显增高。为观察苯诱导的ROS生成增加是否引起NLRP3的活化,本研究应用qPCR和Western blot检测了 BMMNCs的NLRP3的表达,mRNA及蛋白结果均表明BMF模型组BMMNCs的NLRP3表达明显增高。因此,苯诱导的骨髓细胞ROS增高引起的NLRP3炎症小体的活化与骨髓毒性密切相关。4.苯诱导BMF小鼠模型BMMNCs的S期阻滞及CDK4、CyclinD1蛋白表达降低为了观察苯暴露对BMF模型小鼠BMMNCs细胞周期的影响,本研究首先应用流式细胞仪检测了 BMMNCs的细胞周期的改变。发现与对照组相比,BMF模型组小鼠S期细胞百分比明显增加。进一步用Western blot检测周期调控相关的CDK4、Cyclin D1蛋白的表达,发现与对照组相比,BMF模型组小鼠BMMNCs的CDK4、Cyclin D1的蛋白表达明显降低。5.苯诱导BMF小鼠模型外周血造血因子IL-11、IL-2、EPO的失调为了观察苯诱导的BMF是否伴随造血因子的紊乱,本研究应用ELISA检测了血浆IL-11、IL-2、EPO的表达,发现与对照组相比,BMF模型组IL-2及EPO明显增高但IL-11降低,结果表明造血因子的紊乱在苯诱导的BMF发病机制中起一定作用。6.EPS改善了苯诱导的BMF小鼠的体重减轻为了观察EPS对苯诱导的BMF的治疗作用,我们在利用雄性CD1小鼠皮下注射苯的方法成功建立BMF小鼠模型后,给予不同剂量组的EPS灌胃治疗4周。发现与未治疗的BMF小鼠发生的进行性消瘦比较,EH组和EL组小鼠体重增加。这说明EPS具有缓解BMF引起的小鼠体重减轻的作用。7.EPS改善了苯诱导的BMF小鼠的造血损伤EPS治疗4周后,与未治疗的BMF小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠血常规示WBC和PLT计数、Hgb浓度、RC百分比均增加,外周血细胞涂片、骨髓细胞涂片、股骨病理检测均显示骨髓有核细胞增加,这些结果表明,EPS能改善苯诱导的BMF。8.EPS通过下调BAX表达抑制苯诱导的BMMNCs过度凋亡因为观察到苯诱导BMF组小鼠的BMMNCs凋亡率增高,本研究进一步观察了 EPS治疗后小鼠BMMNCs凋亡率的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组比较,EH和EL治疗组小鼠的BMMNCs凋亡率下降,进一步检测凋亡相关基因BAX、BCL-2、Caspase-9,发现EPS治疗组BMMNCs中BAX基因水平降低,Caspase-9、BCL-2则没有明显统计学差异。进一步蛋白结果验证也表明,与未治疗的BMF组比较,EH和EL治疗组小鼠的BMMNCs的BAX蛋白表达降低。这些结果表明,EPS是通过下调BAX基因及蛋白表达发挥抗凋亡作用。9.EPS通过上调CDK4减轻苯诱导的BMMNCs的S期阻滞为了观察EPS改善苯诱导的BMF是否与周期调控有关,本研究进一步检测了 EPS治疗后小鼠BMMNCs细胞周期的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠的S期阻滞减轻,进一步检测CDK4的表达,我们发现EPS治疗组和药物阳性对照CsA组小鼠的BMMNCs的CDK4表达上调。这些结果表明,EPS治疗通过上调CDK4的蛋白表达减轻了苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的S期阻滞。10.EPS通过抑制NLRP3炎症小体的活化减轻苯诱导的氧化应激损伤体外研究已经证实EPS具有抗氧化应激作用,本研究进一步用流式细胞仪检测了 BMMNCs的ROS的水平变化,观察EPS改善苯诱导的BMF与氧化应激损伤的关系。结果发现EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠BMMNCs的ROS的增高受到抑制。qPCR结果显示EH和EL治疗组小鼠BMMNCs的NLRP3的mRNA表达均明显降低。这些结果表明EPS可能通过抑制NLRP3炎症小体的活化发挥减轻苯诱导的骨髓细胞氧化应激损伤。11.EPS改善了外周血CD4+/CD8+T细胞比例及纠正造血因子的失衡为了观察EPS对苯诱导的BMF是否具有免疫调节作用,本研究进一步流式细胞仪检测了 EPS治疗后T淋巴细胞百分比及ELISA检测造血因子水平的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠的CD3+、CD4+细胞百分比及CD4+/CD8+比例明显增加;与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠血浆IL-11增高而IL-2和EPO降低。结果表明经EPS治疗后,苯诱导的BMF引起的T淋巴细胞免疫抑制及造血因子失衡得到缓解,EPS具有增强T淋巴细胞免疫功能和纠正造血因子失衡的作用。二、AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML中作用机制及Brustol逆转策略1.采用吸入法成功建立BZ-AML小鼠模型雄性CBA/Ca小鼠,采用静式吸入苯暴露染毒方法建立BZ-AML小鼠模型,与对照组比较,BZ-AML组小鼠血常规显示WBC、RBC和PLT降低,中性粒细胞百分比增高,外周血及骨髓细胞学涂片显示明显增多的原始细胞;肝脏病理检查显示原始细胞对肝窦的浸润伴脂肪细胞的增多;骨髓病理检查显示有原始细胞浸润骨膜,通过SPE-GC-MS分析苯及其代谢物,结果表明BZ-AML组与对照组相比,其血液、骨髓、肾脏、脾脏和肝脏中的含量明显高于对照组,BZ-AML组BMMNCs出现与人类相似的髓性白血病免疫分型表现:CD34+、CD13+、CD19-。2.苯诱导BZ-AML小鼠的免疫功能抑制建模完成后,应用流式细胞仪检测BZ-AML组和对照组小鼠外周血的T淋巴细胞亚群结果表明,BZ-AML组的CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+的T淋巴细胞明显低于对照组。表明BZ-AML的发病机制与苯诱导的免疫功能明显抑制密切相关。3.苯诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs的NLRP3及NRF2活化BZ-AML组与对照组比较,qPCR及Western blot结果表明BMMNCs的AhR、CYP1A1、NLRP3、NRF2基因和蛋白表达明显增高;免疫组化也表明骨髓组织的NRF2、NLRP3蛋白表达增强,研究结果证明在苯与AhR结合后可进一步诱导BMMNCs及股骨组织NRF2、NLRP3的活化,这可能是BZ-AML的发病机制之一。4.苯诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs凋亡受阻、G0/G1期阻滞BZ-AML组和对照组比较,流式细胞仪结果表明BMMNCs的细胞凋亡受阻、G0/G1期细胞百分比增高,研究结果证明苯诱导了 BMMNCs的凋亡阻遏及G0/G1期阻滞。5.Brusatol治疗能抑制BZ-AML组小鼠BMMNCs的NLRP3及NRF2的活化经Brusatol治疗10天后,1HC及Western blot结果表明与BZ-AML组小鼠比较,Brusatol组小鼠NLRP3、KEAP1及NRF2蛋白的表达明显降低,结果表明Brusatol通过抑制NLRP3及KEAP1-NRF2的活化发挥抗白血病作用。6.Brusatol治疗能诱导BZ-AML小鼠BMMNCs的凋亡经Brusatol治疗10天后,流式细胞仪检测对照组、BZ-AML组、Brusatol组小鼠 BMMNCs 晚期凋亡率分别为 4.27±0.42%,1.20±0.50%,2.14±0.28%。结果表明,Brusatol能诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs的凋亡,从而发挥抗白血病作用。研究结论一、AhR介导的NLRP3炎症小体活化在苯诱导的BMF中发挥重要作用1.苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的ROS过度生成,ROS可引起NLRP3炎症小体的活化;2.苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的凋亡率增加和S期阻滞;3.AhR和CYP1A1在肝脏和骨髓高表达,但骨髓表达增高更明显,其组织的差异表达是苯诱导的BMF造血毒性的重要机制;4.外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞降低及造血因子IL-11、IL-2和EPO的失衡与苯诱导的BMF免疫毒性密切相关。二、EPS通过抗凋亡、抗炎、减轻周期阻滞、增强T细胞免疫功能发挥改善骨髓造血衰竭的作用1.EPS能通过的下调BMMNCs的BAX基因和蛋白的表达发挥抗凋亡作用;2.EPS能通过抑制BMMNCs的NLRP3炎症小体活化、降低ROS生成发挥抗氧化应激作用;3.EPS能通过上调BMMNCs的CDK4蛋白表达减轻S期阻滞的作用;4.EPS通过增加外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比及改善IL-11、IL-2和EPO造血因子的失衡,发挥增强免疫的作用。三、利用CBA/Ca小鼠采用吸入法成功建立BZ-AML小鼠模型1.外周血及骨髓细胞学涂片、肝脏及骨髓病理检查均显示原始细胞增多,结合骨髓细胞的白血病免疫分析:CD34+、CD13+、CD19-,验证了拟人化的BZ-AML动物模型成功构建;2.BZ-AML 小鼠外周血的 CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+T 淋巴细胞免疫功能明显受抑制;3.BZ-AML小鼠存在BMMNCs的凋亡抑制及G0/G1期的阻滞。四、AhR介导的NLRP3炎症小体活化在BZ-AML中发挥调控作用1.BZ-AML 小鼠的 BMMNCs 的 AhR、CYP1A1、NRF2、NLRP3 均表达增强,表明苯和AhR结合后引起了 NRF2、NLRP3活性增强;2.Brusatol通过诱导BMMNCs凋亡增加发挥抗白血病作用;Brusatol明显降低了NLRP3、KEAP1-NRF2相关基因和蛋白的表达,表明Brusatol抗白血病机制与抑制NLRP3炎症小体、KEAP1-NRF2的活化密切相关。创新性和意义1.明确了在苯诱导的BMF小鼠模型中,苯暴露引起BMMNCs的ROS过度生成并伴随NLRP3炎症小体的活化;2.体内实验证明了 EPS、Brusatol对苯诱导的BMF、AML具有治疗作用;3.体内实验证明EPS、Brusatol可能通过抑制NLRP3活性发挥改善骨髓造血毒性的作用;4.发现了 AhR和CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠的肝脏和骨髓的差异性表达,其在骨髓的增高更为显着,为苯的造血毒性机制提供了新观点;5.研究结果为EPS、Brusatol治疗苯诱导的BMF、AML不同造血毒性的临床应用奠定了实验基础。局限性1.未进行体外细胞培养深入探究苯诱导的ROS生成与NLRP3炎症小体的活化的剂量-效应关系,故ROS水平与NLRP3炎症小体活化的浓度-效应关系尚未确定;2.由于时间的关系,未深入研究苯与胞浆的AhR结合后是如何调控胞内NLRP3活化的具体分子通路。
杨万斌[7]（2019）在《齐多夫定对小鼠糖尿病的诱导作用及青蒿琥酯的干预作用研究》文中研究说明背景和目的糖尿病（Diabetes）,一种以高血糖为主要特征的代谢性疾病。其高血糖的发生原因是胰岛素分泌出现缺陷,或胰岛素敏感性下降导致其生物作用受损,或者是以上两个原因兼有。糖尿病后期由于长期较高的血糖,可导致多种组织发生并发症,包括血管、神经、眼、心脏、肾脏等出现慢性损伤,以至功能障碍。而对于糖尿病前期的糖代谢异常如果能够加以控制,患者的发病年龄能得到延缓,并减轻糖尿病病情。而另一方面,单基因糖尿病的发生也是一个需要得到注意的问题,单基因糖尿病是由于一个或多个缺陷单基因而导致的糖尿病,约占儿童糖尿病总发病例数的1%～4%。迄今己发现40多种单基因糖尿病,主要包括青年发病成人型糖尿病（MODY）、新生儿糖尿病和线粒体糖尿病、单基因胰岛素抵抗综合征等。当前国内对于单基因糖尿病的诊断尚无有效手段,作者认为,出生12个月内被诊断为糖尿病的婴儿,应进行基因检测;而缺乏1型糖尿病或2型糖尿病特征的糖尿病患者,也需要进行基因检测。单基因糖尿病还需要个体化的的治疗手段,但其前提是对单基因糖尿病进行精确诊断与分型。临床服用齐多夫定（zidovudine,AZT）的病人中,3%-4%的病人可因齐多夫定的毒副作用而发生糖尿病,目前认为该类糖尿病为2型糖尿病,但对齐多夫定导致糖尿病的具体过程和机制尚不清楚,然而,齐多夫定作为一种核苷逆转录酶抑制剂,属于核苷类似物,其具有线粒体毒性,可导致骨髓抑制、贫血、线粒体肌病、乳酸酸中毒等。对齐多夫定诱发的毒副作用,作者认为可能均来自于齐多夫定的线粒体毒性,由于线粒体功能受损,ATP合成减少,导致下游多种细胞代谢和蛋白质合成过程不能顺利进行,包括GLUT2和GLUT4等多种葡萄糖转运蛋白,导致细胞对外周血糖吸收和胰岛β细胞的胰岛素分泌功能下降等,同时胰岛素的合成不足均可导致糖尿病的发生。本次研究为了验证上述机理,解开齐多夫定导致糖尿病的诱因和机制,并给予临床服用齐多夫定而导致糖尿病的病人更准确的用药标准,同时也希望引起人们对单基因糖尿病的重视。方法造模剂量研究,用于确定最佳的诱导剂量:将小鼠分为正常组、齐多夫地超高剂量组（以下简称齐超组）、齐多夫定高剂量组（齐高组）、齐多夫定中剂量组（齐中组）、齐多夫定低剂量组（齐低组）,后四组分别以不同剂量齐多夫定溶液予以小鼠自由饮用,实验持续8周,此8周期间,每2周进行1次小鼠的口服葡萄糖耐量检测（OGTT）和胰岛素抵抗检测（IR）。第8周麻醉小鼠后取血,取胰腺,血液用于血清胰岛素浓度检测,胰腺组织部分以福尔马林固定以备组织学检查,部分冻存以备后期使用。造模方法研究,用于确定最佳的诱导方法:将小鼠分为正常组、模型组（饮用齐多夫定溶液联合食用高脂饲料）、HFD组（单纯食用高脂饲料）、AZT组（单纯饮用齐多夫定溶液,所用剂量为造模剂量研究得出的最佳剂量）,实验持续8周,此8周期间,每2周进行1次小鼠的口服葡萄糖耐量检测（OGTT）和胰岛素抵抗检测（IR）。第8周麻醉小鼠后取血,取胰腺,血液用于血清胰岛素浓度检测,胰腺组织部分以福尔马林固定以备组织学检查,部分冻存以备后期使用。治疗药物干预实验,用于观察药物对模型小鼠的治疗干预效果,并了解青蒿琥酯的最佳治疗剂量:将小鼠分为正常组、模型组、青蒿琥酯高剂量组（以下简称青高组）、青蒿琥酯中剂量组（青中组）、青蒿琥酯低剂量组（青低组）以及阳性治疗组（阳性组）,其中青高组给予模型组同样的造模方法,同时予lOmg/kg青蒿琥酯干预;青中组予5mg/kg青蒿琥酯干预;青低组予lmg/kg青蒿琥酯干预;阳性组予二甲双胍干预,持续8周。期间,每2周进行1次小鼠口服葡萄糖耐量检测（OGTT）和胰岛素抵抗检测（IR）。第8周麻醉小鼠后取血,取胰腺,血液用于血清胰岛素浓度检测,胰腺组织部分用于纯化线粒体呼吸控制率（RCR）检测,部分以福尔马林固定以备组织学检测,部分以戊二醛固定用于电镜检测,部分液氮冻存用于聚合酶链式反应（PCR）和免疫印迹（western blot,WB）检测。结果（1）造模剂量研究实验显示,四种造模剂量中,低剂量AZT对小鼠血糖无影响作用;超高剂量AZT对提高血糖作用最明显,但具有较高致死率;高剂量AZT较中剂量AZT对血糖作用更明显,同时造成的小鼠死亡率也较低。因此选用高剂量AZT（400mg/kg）作为AZT的造模剂量,但高剂量组小鼠的糖尿病成模率仍较低。（2）三种造模方法研制小鼠糖尿病模型实验显示,模型组小鼠（自由饮用齐多夫定溶液同时食用高脂饲料）的糖耐量降低较正常组、高脂饮食组和AZT组更明显,随机血糖也较另外三组更高,同时成模率接近100%,可以认为采用自由饮用齐多夫定溶液联合食用高脂饲料的方法能更快更明显地诱导小鼠糖尿病模型。（3）治疗药物对该小鼠模型的干预作用二甲双胍和青蒿琥酯中剂量组能一定程度降低小鼠糖尿病模型的随机血糖,提高糖耐量,青蒿琥酯高剂量组反而有加重小鼠糖尿病的趋势,空腹血糖升高和糖耐量降低均比模型组明显,可能与青蒿琥酯高剂量组的青蒿玻酯用药浓度过高有关。（4）通过RCR、PCR和WB检测等检测,本研究所造成的小鼠糖尿病模型为线粒体糖尿病,该疾病的发生发展与AZT造成的线粒体毒性有关。结论（1）自由饮用齐多夫定溶液结合高脂饮食的方法能用于诱导小鼠糖尿病模型,较之单纯饮用齐多夫定溶液或单纯食用高脂饲料的方法,其造模作用更明显。（2）二甲双胍和中剂量青蒿琥酯对该糖尿病模型有一定的缓解治疗作用,但高剂量青蒿琥酯反而起到加重病情的作用,因此需注意青蒿琥酯的用药剂量。（3）通过齐多夫定结合高脂饮食方法造成的糖尿病模型属于线粒体糖尿病模型。
许志亮[8]（2019）在《CUL4B缺失增强髓源抑制细胞促瘤能力的机制研究》文中进行了进一步梳理Cullin4B（CUL4B）属于Cullin家族,该家族成员是目前已知的最大的一类E3泛素连接酶复合物（Cullin-RING E3 ligase,CRLs）的骨架蛋白,通过泛素化修饰底物蛋白而发挥生物学功能。目前发现,CUL4B在胚胎发育、神经发育、DNA损伤修复、细胞周期、细胞分化以及肿瘤的发生和发展等多种生命活动中具有重要的调控功能。CUL4B丧失功能突变导致个体发育异常,而CUL4B在食管癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、胃癌以及卵巢癌等实体瘤中高表达、发挥癌基因作用。髓源抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cell,MDSCs）来源于骨髓造血干细胞,是一类未成熟的髓系细胞,在炎症、自身免疫疾病和肿瘤等多种病理条件下发生累积和活化,影响机体免疫能力。实验室的前期研究结果显示,造血系统敲除Cul4b导致小鼠CD1lb+Grl+细胞群累积和活化。移植瘤模型分析显示,宿主造血系统缺失Cul4b促进移植瘤生长和转移,并促进MDSCs的累积和活化。提示Cul4b在肿瘤微环境中发挥抑癌基因的作用。为探究髓系细胞缺失Cul4b是否也能促进移植瘤的生长和转移以及Cul4b缺失型MDSCs促进肿瘤生长和转移的分子机制,本课题进行了如下探究。第一部分CUL4B缺失增强髓源抑制细胞促瘤潜力为了探究髓系细胞缺失Cul4b能否促进移植瘤的生长,我们利用Cre-loxp系统建立了髓系细胞特异性敲除Cul4b基因条件性敲除小鼠（MKO）,并进行了以下分析:1.构建髓系细胞特异性敲除Cul4b基因小鼠模型为获得髓系细胞特异性敲除Cul4b基因小鼠,将实验室前期构建的Cul4bflox基因打靶小鼠与LysM-Cre+/-转基因鼠交配,获得了Cul4bflox/Y;LysM-Cre+/-条件性敲除小鼠（MKO）。利用Western-Blot和实时定量PCR技术证实Cul4b在MKO小鼠MDSCs中得到有效敲除。流式细胞术检测发现,MKO小鼠血液中CD11b+Gr1+细胞比例明显高于野生型小鼠,并且MKO小鼠脾脏略大于野生型小鼠。2.宿主髓系细胞缺失Cul4b促进移植瘤生长并伴随MDSCs累积B16/F0细胞荷瘤实验发现,MKO小鼠皮下肿瘤生长能力明显高于野生型小鼠,并伴随血液、骨髓和脾脏中MDSCs异常累积,这与阳性对照Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-小鼠（TKO）移植瘤生长能力及MDSCs累积相一致。BALB/c来源的4T1细胞荷瘤实验发现,MKO小鼠排斥异源细胞的能力显着低于野生型小鼠。3.CUL4B缺失导致MDSCs促瘤潜力增强为了明确MKO小鼠增加的促瘤能力是MDSC介导的,我们将肿瘤细胞与从WT和MKO荷瘤小鼠分离得到的MDSCs分别共注射到野生型C57BL/6小鼠,结果发现Cul4b缺失型MDSCs具有更强的促瘤能力和促转移能力;对MDSCs的组成分析未检测到两种基因型小鼠M-MDSCs和G-MDSCs的组成上存在明显差异。以上结果显示,髓系细胞特异性敲除Cul4b促进移植瘤生长,而且这种作用是通过增加MDSCs活性介导的。第二部分CUL4B调控MDSCs的非T细胞依赖性促瘤潜力MDSCs促进肿瘤生长和转移的途径根据是否依赖于T细胞分为T细胞依赖性和非T细胞依赖性促瘤途径。为明确CUL4B在调控MDSCs非T细胞依赖性促瘤途径中的作用,我们进行了以下分析:1.利用裸鼠荷瘤实验分析CUL4B缺失对MDSCs促瘤能力的影响将肿瘤细胞与MDSCs以1:3混合注射到无胸腺裸鼠皮下,结果发现MKO-MDSCs具有更强的促瘤能力。2.利用共培养体系分析CUL4B缺失对MDSCs促瘤能力的影响MKO-MDSCs与肿瘤细胞共培养,对共培养后4T1细胞进行平板克隆分析,结果发现与MKO-MDSCs共培养的4T1细胞表现出更强的增殖能力;细胞凋亡检测发现与MKO-MDSCs共培养的B16/F0细胞凋亡减少;流式细胞术检测分析发现与MKO-MDSCs共培养的B16/F0细胞中CD133+细胞、4T1细胞中CD44+CD24low细胞群明显增加,显示干细胞比例增加;成球实验也表明与MKO-MDSCs共培养的4T1细胞具有更强的成球能力;实时定量PCR结果显示与MKO-MDSCs共培养的肿瘤细胞中Sox2,Nanog和Oct4等干性基因的表达明显高于与WT-MDSCs共培养的细胞。体内实验也发现,与MKO-MDSCs共培养的B16/F0细胞具有更强的成瘤能力。3.利用条件培养基分析CUL4B缺失对MDSCs促瘤能力的影响为了探究CUL4B缺失增强MDSCs促瘤能力的机制,我们利用MDSCs条件培养基和MEFs条件培养基处理4T1细胞。结果发现MKO-MDSCs条件培养基具有更强的促进肿瘤细胞的增殖作用;干性表面标志物流式细胞术检测发现经MKO-MDSCs条件培养基处理的B16/F0细胞CD133+细胞、4T1细胞中CD44+CD24low细胞群明显增加;成球实验也表明经MKO-MDSCs条件培养基处理的4T1细胞具有更强的成球能力。实时定量PCR结果显示经MKO-MDSCs条件培养基处理的肿瘤细胞中Sox2,Nanog和Oct4等干性基因的表达明显高于经WT-MDSCs条件培养基处理的细胞。体内实验发现,经MKO-MDSCs条件培养基处理的B16/F0细胞具有更强的成瘤能力和转移能力。以上结果显示,髓系细胞缺失CUL4B可能是通过改变MDSCs分泌因子而发挥更强的促瘤作用。第三部分CUL4B通过调控IL-6/p-STAT3通路促进肿瘤细胞干性为寻找CUL4B调控的MDSCs分泌因子及其调控机制,本部分进行了以下分析:1.CUL4B缺失型MDSCs分泌更多的IL-6为了探究MKO-MDSCs条件培养基促进肿瘤细胞增殖和干性的分泌因子,我们利用3 kD分子筛以及加热处理分析不同组分条件培养基的作用,结果发现,促进肿瘤细胞增殖的物质存在于大于3 kD的MKO-MDSCs条件培养基组分中,并且这种物质具有热不稳定性;通过ELISA实验检测MDSCs条件培养基以及小鼠血清中细胞因子的表达情况,结果发现,IL-6在MKO-MDSCs条件培养基中高表达,并且在肿瘤形成早期MKO小鼠血清中的IL-6含量也明显高于WT小鼠。为进一步证实MKO-MDSCs条件培养基增高的促瘤作用是通过增加的IL-6分泌介导的,我们利用anti-IL-6中和抗体进行了封闭实验,结果发现anti-IL-6中和抗体能够有效降低MKO-MDSCs条件培养基促进肿瘤细胞增殖和干性的作用。2.IL-6激活肿瘤细胞STAT3信号通路IL-6作为细胞因子发挥生物学功能,需要通过细胞膜受体影响肿瘤细胞中关键信号通路的变化,因此我们检测了 IL-6下游JAK/STAT3信号通路的变化。结果发现,来自于MKO-MDSCs共注射的肿瘤以及来自于MKO小鼠移植瘤中的p-STAT3（Y705）水平明显高于相应的WT组,并且MKO-MDSCs条件培养基具有更强的激活肿瘤细胞p-JAK2（S1007/1008）和p-STAT3（Y705）能力。为了探究MKO-MDSCs促进肿瘤细胞的增殖和干性是通过激活肿瘤细胞STAT3引起的,我们利用p-STAT3抑制剂（Stattic）和干扰4T1细胞STAT3表达进行了拯救实验,结果显示,无论是抑制剂Stattic处理还是干扰STAT3表达均能有效降低MKO-MDSCs条件培养基促进肿瘤细胞增殖和干性的作用。3.CRL4B/HDAC/PRC2复合物抑制IL-6基因转录为分析CUL4B缺失增加MDSCs分泌IL-6的机制,我们首先通过实时定量PCR、Western-blot实验以及ELISA实验从RNA和蛋白质水平检测了 CUL4B缺失对IL-6表达的影响,发现MKO-MDSCs和CUL4B敲低RAW264.7细胞中IL-6的mRNA和蛋白水平均明显上调,并且发现在小鼠荷瘤模型和肿瘤患者外周血MDSCs中IL-6转录水平与CUL4B呈负相关,提示CUL4B抑制Il-6转录。为了探究CUL4B抑制Il-6转录的机制,我们利用ChIP实验发现CUL4B、H2AK119ubl、EZH2、DNMT3A、HDAC1和HDAC3 在Il-6 转录起始位点上游1023～1140区域均有结合,qChIP实验显示CUL4B通过招募PRC2和HDAC复合物调控Il-6的转录。利用HDAC抑制剂（TSA）和PRC2复合物抑制剂（Dzep）处理CUL4B高表达的Raw264.7细胞,结果发现TSA和Dzep均能拯救CUL4B过表达对IL-6的抑制作用。综上所述,本课题研究得出如下结论:1.髓系细胞特异性敲除Cul4b基因导致小鼠MDSCs累积及活性增强;2.CUL4B缺失增强MDSCs的非T细胞依赖性促瘤潜力;3.CUL4B缺失导致MDSCs分泌更多的IL-6,进而通过激活肿瘤细胞中STAT3信号通路促进肿瘤细胞增殖和干性;4.CRL4B复合物协同HDAC和PRC2复合物抑制Il-6的转录。
强天遥[9]（2019）在《基于pink1基因探讨补阴牵正方对帕金森病线粒体的保护机制》文中进行了进一步梳理研究背景帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种以中脑黑质多巴胺（Dopamine,DA）神经元变性丢失为主要病理特征的神经退行性疾病,临床症状以进行性运动障碍为主。PD的患病率随年龄增长而增加,中国的发病例数约占全球的一半。PD不仅给患者家庭带来巨大的经济负担,也显着降低了病人及家属的生活质量。因此寻找治疗PD的理想方法显得愈加迫切。PD的病因病机尚不明确,但线粒体功能障碍可引起PD已得到广泛认可。PINK1蛋白主要定位于线粒体发挥作用,其基因突变和蛋白功能缺陷均可引起线粒体功能障碍,导致PD。现有大量研究显示,PINK1与下游的Parkin蛋白构成的PINK1/Parkin通路,可调节线粒体分裂和融合,但具体的调控机制仍待研究。PD尚无有效根治的方法,基于整体观念和辨证论治理论体系的祖国医药,可针对PD的多个靶点起到治疗作用,明显改善PD患者症状,不良反应小,具有独特的优势。因此,进一步探讨中药的作用机制,寻求治疗PD更为有效的方法,具有重要意义。我们前期的研究证实由大补阴丸和牵正散组成的补阴牵正方可改善PD模型小鼠脑线粒体功能,也可维持PD细胞模型线粒体质量。在此基础上,本研究基于pink1基因进一步探讨补阴牵正方对PD中线粒体质量的分子调控机制。研究目的以pink1基因为切入点:①揭示补阴牵正方对PD细胞和动物模型中线粒体形态和功能的保护作用,阐明补阴牵正方对PD线粒体的这一保护与pink1基因调控的相关性。②从PINK1/Parkin通路与线粒体分裂、融合蛋白之间的密切联系,进一步探寻补阴牵正方保护PD线粒体形态和功能的靶点和分子机制。为临床应用中药防治PD以及中药的进一步开发运用提供科学依据。研究方法本研究主要分为细胞和动物两部分实验。第一部分为细胞实验,包含实验一至实验三。实验一 SH-SY5Y细胞pink1过表达模型构建。酶切连接构建pink1过表达质粒后,扩增提取及测序鉴定,然后采用脂质体介导法瞬时转染SH-SY5Y细胞,使用荧光倒置显微镜、流式细胞分析仪、qPCR和Western Blot技术检测其pink1过表达基因转染效果。实验二补阴牵正方对pink1过表达PD细胞模型线粒体形态和功能的影响。CCK-8法检测各组细胞的存活率;利用MitoTracker（?）Red CMXRos探针标记技术,激光共聚焦扫描显微镜观察各组细胞线粒体的形态和活性;荧光素酶法检测各组细胞线粒体ATP水平;利用Tetramethylrhodamine methyl ester探针标记技术,激光共聚焦扫描显微镜观察并检测细胞线粒体膜电位。实验三补阴牵正方对pink1基因过表达PD细胞模型线粒体分裂/融合的影响。Western Blot技术检测PINK1和Parkin蛋白的表达;免疫荧光双标技术分别检测细胞Parkin蛋白与PINK 1蛋白的共定位关系、Parkin蛋白与线粒体的共定位关系;Western Blot技术检测线粒体融合蛋白1（Mitofusin 1,Mfh1）、融合蛋白2（Mitofusin 1,Mfn2）和视神经萎缩蛋白（Optic atrophy 1,OPAl）及线粒体分裂动力相关蛋白1（Dynamic related protein 1,Drp1）和线粒体分裂蛋白 1（Mitochondrial fission protein 1,Fis1）的表达。第二部分为动物实验,包含实验四至实验七。实验四C57BL/6J小鼠脑pink1过表达模型构建。构建pink1过表达腺相关病毒载体,利用脑立体定位技术注射其载体进入C57BL/6J小鼠左侧纹状体。采用激光扫描共聚焦显微镜观察EGFP的表达情况,qPCR和Western Blot技术检测小鼠脑内pink1 mRNA和PINK1蛋白的表达,鉴定pink1基因过表达效果。实验五补阴牵正方对脑pink1过表达PD小鼠的防治作用。爬杆和抓握实验检测小鼠行为学;免疫荧光技术观察小鼠中脑黑质酪氨酸氧化酶（Tyrosineoxidase,TH）阳性神经元数量;高效液相电化学法检测小鼠前脑DA及其代谢产物含量。实验六补阴牵正方对脑pink1过表达PD小鼠线粒体形态和功能的影响。电镜观察中脑黑质神经元的超微结构;比色法测定脑线粒体复合物I活性;荧光素酶法检测脑ATP含量;JC-1法检测脑线粒体膜电位水平。实验七补阴牵正方对脑pink1过表达PD小鼠线粒体分裂/融合的影响。Western Blot技术检测脑内PINK1和Parkin的表达;免疫荧光双标技术分别检测黑质内PINK1蛋白、Parkin蛋白与线粒体外膜蛋白TOM20的共定位关系;Western Blot技术检测脑线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1和线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1的表达。研究结果1.克隆质粒中目的基因序列与原基因序列一致,pink1过表达质粒构建成功。与正常对照组相比,pink1过表达组和阴性对照组可明显检测到绿色荧光蛋白;pink1过表达组的pink1 mRNA和PINK1蛋白的表达都显着提高。说明SH-SY5Y细胞pink1过表达模型构建成功。2.MPP+可造成SH-SY5Y细胞存活率下降,线粒体碎裂,线粒体活性、ATP含量以及线粒体膜电位降低,补阴牵正方和pink1过表达能够拮抗MPP+造成的这些损伤,二者联用这一作用增强。3.补阴牵正方和pink1过表达均能够显着改善MPP+造成的PINK1、Parkin蛋白、线粒体融合蛋白Mfn1/2的表达降低;还可抑制线粒体分裂蛋白Drp1蛋白表达升高;可降低Parkin蛋白与线粒体以及Parkin蛋白与PINK1蛋白的共定位,且二者联合处理时,这一作用增强。此外,补阴牵正方可明显拮抗MPP+造成的OPA1表达降低和Fis1蛋白表达升高,但单独的pink1过表达此作用不明显。4.克隆质粒中目的基因序列与pink1基因序列一致,pink1过表达腺相关病毒构建成功。在纹状体注射后,阴性对照组和脑pink1过表达组小鼠纹状体均见明显绿色荧光,且pink1过表达组脑pink1 mRNA和蛋白的表达较正常对照组和空载对照组都显着提高。说明C57BL/6J小鼠脑pink1过表达模型构建成功。5.pink1过表达和补阴牵正方可明显拮抗MPTP造成的C57BL/6J小鼠协调运动障碍,黑质TH阳性神经元数量的减少及前脑DA含量的降低;联合pink1过表达处理时,上述拮抗作用均增强,对MPTP造成的PD小鼠前脑多巴胺代谢产物DOPAC含量的减少也有明显改善作用。6.补阴牵正方和pink1过表达均可明显拮抗MPTP造成的PD小鼠黑质神经元和线粒体的损伤、脑线粒体膜电位和ATP含量的减低;此外,补阴牵正方可明显拮抗MPTP造成脑线粒体复合物I活性降低,联合pink1过表达处理,这一拮抗作用增强。7.补阴牵正方和pink1过表达均能够显着改善MPTP造成的C57BL/6J小鼠脑PINK1蛋白和Parkin蛋白表达降低,二者联用效果更好。补阴牵正方和pink1过表达还并可降低中脑黑质PINK1和Parkin蛋白与线粒体外膜标志蛋白TOM20的共定位。pink1过表达和补阴牵正方均能够显着改善PD小鼠脑线粒体融合蛋白Mfn1/2和OPA1表达降低,线粒体分裂蛋白Drpl和Fis1蛋白表达的升高。联合pink1过表达处理时,补阴牵正方可增加PD小鼠脑线粒体融合蛋白Mfn1/2蛋白的表达,降低线粒体分裂蛋白Fis1蛋白的表达。结论1.中药补阴牵正方和pink1过表达在离体和整体水平均可以通过增加PINK1蛋白表达,调节PINK1/Parkin通路,进而维持线粒体分裂融合的动态平衡,发挥对PD线粒体形态和功能的保护作用。补阴牵正方在pink1过表达的情况下,能更好的发挥防治PD的保护作用。2.补阴牵正方治疗PD的作用机制与pink1基因有密切关系,补阴牵正方可能通过上调PINK1蛋白表达进而调节PINK1/Parkin通路以及线粒体融合和分裂相关蛋白表达,以改善线粒体形态和功能、保护线粒体质量,从而发挥最佳神经保护作用。
谭禄彬[10]（2018）在《内侧缰核到脚间核通路乙酰胆碱及其alpha5亚型受体功能》文中进行了进一步梳理内侧缰核（MHb）到脚间核（IPN）通路是背侧间脑传导系统（DDC）的重要组成部分,是连接前脑和后脑的重要信息中继站之一。已有研究表明MHb-IPN影响运动感觉传输、社交行为、药物滥用以及一些情绪性行为,但是其亚核团功能区分和神经元类型并不清楚。本研究利用转基因技术、细胞遗传学、化学遗传学等方法敲除、标记、损毁、激活和抑制特定类型神经元,以观察其行为学效应。我们首先运用CRISPR-Cas9转基因技术构建了6个MHb高表达基因的敲除小鼠品系,行为实验表明分布在ventral MHb的CNNM2和TSPAN18小鼠恐惧记忆不能消退,而分布于superior MHb的SYT6不影响恐惧记忆的消退,只影响恐惧记忆的整体水平或者可能影响小鼠对电击的感受和恐惧记忆的学习,分布于整个MHb的TMEM176A/B和HCN3行为表现介于二者之间,它们的恐惧水平增加,但恐惧记忆消退速度未被显着影响。细胞遗传学方法特异性损毁Ventral MHb减缓小鼠恐惧记忆消退,dorsal MHb损毁不但减缓小鼠恐惧记忆消退,且dorsal MHb还参与了恐惧记忆的形成,而模拟MHb递质释放激活IPN可以加快小鼠恐惧记忆消退。环路示踪分析也表明了BAC-dorsal MHb和LPO-Ventral MHb两条特异性通路,说明了MHb参与了小鼠恐惧记忆的形成与消退去具有亚核团特异性。Ventral MHb损毁降低小鼠的焦虑水平、减弱小鼠社交动机、对环境的适应能力下降、认知能力和气味分辨能力受损,但不影响小鼠的奖赏感受能力。我们通过检测个体IPN CHRNA5基因表达水平,发现大鼠群体中CHRNA5基因表达水平可以显着分为两个群体,CHRNA5基因表达水平与大鼠尼古丁摄入量成正相关关系,且CHRNA5基因的本底表达并不受尼古丁摄入的影响。CRE重组酶特异性敲入的转基因大鼠可以实现特异性标记IPN CHRNA5神经元,不同浓度的尼古丁可以激活MHb和IPN神经元,化学遗传学方法激活IPN CHRNA5神经元可以增加大鼠尼古丁摄入,抑制IPN CHRNA5神经元可以减少大鼠尼古丁摄入。本文的研究表明MHb影响小鼠恐惧记忆形成和消退,以及与这些行为相关的情绪性行为表达,并且具有亚核团特异性;本文还发现IPN CHRNA5神经元控制大鼠尼古丁摄入,本研究为相关精神紊乱和尼古丁成瘾研究提供新的视角。
二、Fv-4基因杂合子小鼠对Fr.MuLV感染的敏感性差异的分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Fv-4基因杂合子小鼠对Fr.MuLV感染的敏感性差异的分析（论文提纲范文）
（1）FoxO1在大口黑鲈糖脂代谢中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 大口黑鲈养殖行业现状 |
| 1.2 大口黑鲈对淀粉利用的研究进展 |
| 1.2.1 大口黑鲈对淀粉的需求量 |
| 1.2.2 大口黑鲈糖不耐受的原因 |
| 1.2.3 提高大口黑鲈对淀粉利用的策略 |
| 1.2.3.1 早期高糖营养程序化 |
| 1.2.3.2 遗传选育 |
| 1.2.3.3 外源淀粉酶 |
| 1.2.3.4 肠道微生物 |
| 1.3 FoxO1在哺乳动物中研究进展 |
| 1.3.1 FoxO1的结构及生理功能 |
| 1.3.2 FoxO1磷酸化位点的研究 |
| 1.3.2.1 胰岛素-AKT-FoxO1通路 |
| 1.3.2.2 PKA-FoxO1通路 |
| 1.3.2.3 FoxO1 的其他磷酸化位点 |
| 1.3.3 FoxO1在葡萄糖代谢中的作用 |
| 1.3.4 FoxO1在脂代谢中的作用 |
| 1.3.5 FoxO1在肝病中的作用 |
| 1.3.5.1 FoxO1在非酒精性脂肪性肝炎中的作用 |
| 1.3.5.2 FoxO1在肝纤维化中的作用 |
| 1.3.5.3 FoxO1在糖尿病中的作用 |
| 1.4 FoxO1在鱼类中的研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 高淀粉饲料对大口黑鲈营养代谢的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验设计 |
| 2.1.2 样品采集 |
| 2.1.3 化学分析 |
| 2.1.4 血浆及肝匀浆生化指标 |
| 2.1.5 肝脏组织病理分析 |
| 2.1.6 mRNA表达水平检测 |
| 2.1.7 自动化western blots |
| 2.1.8 免疫组化 |
| 2.1.9 免疫荧光联染 |
| 2.1.10 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 高淀粉饲料对大口黑鲈生长性能和形体指标的影响 |
| 2.2.2 高淀粉饲料对大口黑鲈血浆和肝匀浆生化指标的影响 |
| 2.2.3 高淀粉饲料对大口黑鲈糖代谢、肠道葡萄糖转运和淀粉酶活性的影响 |
| 2.2.4 高淀粉饲料对大口黑鲈肝脏脂代谢、胆固醇和胆汁酸代谢的影响 |
| 2.2.5 大口黑鲈肝脏组织病理分析 |
| 2.2.6 高淀粉饲料对大口黑鲈肝脏炎症和凋亡因子的影响 |
| 2.2.7 高淀粉饲料对大口黑鲈能量代谢的影响 |
| 2.2.8 高淀粉饲料抑制AKT-FoxO1磷酸化诱导糖脂代谢紊乱 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 大口黑鲈FoxO1基因克隆、组织表达及功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验鱼的养殖及样品采集 |
| 3.1.2 FoxO1基因cDNA序列的克隆 |
| 3.1.2.1 总RNA提取和反转录 |
| 3.1.2.2 FoxO1 cDNA片段的克隆 |
| 3.1.2.3 FoxO1基因cDNA5'-和3'-RACE |
| 3.1.3 FoxO1基因序列分析 |
| 3.1.4 FoxO1表达质粒的构建 |
| 3.1.5 细胞转染及细胞存活率 |
| 3.1.6 FoxO1的组织表达分析 |
| 3.1.7 自动化western blots |
| 3.1.8 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 大口黑鲈FoxO1的cDNA序列特征 |
| 3.2.2 大口黑鲈FoxO1氨基酸的结构特征 |
| 3.2.3 大口黑鲈FoxO1进化树分析 |
| 3.2.4 大口黑鲈FoxO1 mRNA组织表达 |
| 3.2.5 SC79和Perifosine对HEK293T细胞存活率的影响 |
| 3.2.6 AKT对FoxO1磷酸化调控的作用 |
| 3.2.7 AKT对FoxO1核移位的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 大口黑鲈注射葡萄糖或胰岛素-葡萄糖对糖代谢影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验设计及样品采集 |
| 4.1.2 血浆及肝匀浆生化指标 |
| 4.1.3 mRNA表达水平检测 |
| 4.1.4 自动化western blots |
| 4.1.5 统计分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 大口黑鲈注射葡萄糖或胰岛素-葡萄糖对血浆葡萄糖和胰岛素的影响 |
| 4.2.2 大口黑鲈注射葡萄糖或胰岛素-葡萄糖对肝脏糖代谢的影响 |
| 4.2.3 大口黑鲈注射葡萄糖或胰岛素-葡萄糖对肝脏AKT-FoxO1通路的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 FoxO1在大口黑鲈原代肝细胞糖脂代谢中的作用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验设计 |
| 5.1.2 mRNA表达水平检测 |
| 5.1.3 细胞的存活率 |
| 5.1.4 细胞TG含量检测 |
| 5.1.5 统计分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 葡萄糖和AS1842856对大口黑鲈原代肝细胞存活率的影响 |
| 5.2.2 AS1842856对大口黑鲈原代肝细胞糖代谢的影响 |
| 5.2.3 AS1842856对大口黑鲈原代肝细胞脂代谢的影响 |
| 5.2.4 AS1842856对大口黑鲈原代肝细胞Chrebp和Srebp1基因表达的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 FoxO1对pck、chrebp和srebp1启动子活性的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验鱼的饲养及样品采集 |
| 6.1.2 pck、chrebp和srebp1启动子克隆 |
| 6.1.2.1 DNA提取 |
| 6.1.2.2 启动子克隆 |
| 6.1.2.3 转录起始位点确定 |
| 6.1.3 pck、chrebp和srebp1启动子区5'截断片段载体构建 |
| 6.1.3.1 pck、chrebp和srebp1启动子5'截断片段的扩增 |
| 6.1.3.2 启动子5'截断片段与表达质粒重组连接、转化与质粒提取 |
| 6.1.4 pck、chrebp和srebp1启动子定点突变 |
| 6.1.5 细胞转染及细胞存活率 |
| 6.1.6 双荧光素酶活性检测 |
| 6.1.7 统计分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 pck、chrebp和srebp1启动子序列分析 |
| 6.2.2 pck、chrebp和srebp1启动子活性分析 |
| 6.2.3 FoxO1过表达及AS1842856对pck启动子活性及定点突变分析 |
| 6.2.4 FoxO1过表达及AS1842856对chrebp启动子活性及定点突变分析 |
| 6.2.5 FoxO1过表达及AS1842856对srebp1启动子活性及定点突变分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 结论 |
| 第七章 全文结论 |
| 第八章 创新点与后续研究展望 |
| 8.1 创新点 |
| 8.2 后续研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）基于GAT-2探讨抑郁症肝郁脾虚证及逍遥散干预机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 slc6a13基因对小鼠行为和生理功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 行为学结果 |
| 3.2 ELISA的结果 |
| 3.3 IHC的结果 |
| 3.4 qPCR的结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 抑郁症肝郁脾虚证slc6a13~(-/-)小鼠模型的建立与评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 造模对小鼠行为的影响 |
| 3.2 造模对小鼠血浆指标的影响 |
| 3.4 造模对小鼠海马组织PI3k/Akt/mTOR信号通路的影响 |
| 3.5 造模对小鼠的海马突触可塑性的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 逍遥散对slc6a13~(-/-)抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠的作用及机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Western Blot检测蛋白表达水平 |
| 1.2.2 slc6a13~(-/-)小鼠行为学特征分析 |
| 1.2.3 slc6a13~(-/-)小鼠生理特征分析 |
| 2 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 逍遥散治疗对小鼠行为学影响的结果 |
| 3.2 逍遥散治疗对小鼠血浆指标的影响 |
| 3.3 逍遥散治疗对小鼠海马神经元的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 逍遥散含药血清干预抑郁症肝郁脾虚证小鼠海马神经元的效果研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 小鼠海马神经元细胞分离、培养及鉴定 |
| 2. 统计方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 逍遥散含药血清对海马神经元PI3k/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.2 逍遥散含药血清对海马神经元突触可塑性的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 抑郁症肝郁脾虚证血液指标及GAT-2mRNA的价值 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 病例资料 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2. 数据统计与分析 |
| 3. 研究结果 |
| 3.1 一般情况及HAMD得分的组间差异 |
| 3.2 血浆BDNF及pro-BDNF浓度的组间差异 |
| 3.3 血浆单胺类神经递质浓度的组间差异 |
| 3.4 血浆Glu、GABA浓度及代谢酶浓度的组间差异 |
| 3.5 GAT-2mRNA表达的组间差异 |
| 3.6 GAT-2mRNA对抑郁症肝郁脾虚证的诊断价值 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 综述: GAT-2的结构、功能及与抑郁症的关系 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间以第一作者发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）人SP-B基因1580C/T多态性与铜绿假单胞菌肺炎致肺损伤易感性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 转人SP-B基因小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型的建立及肺损伤的观察 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第二部分 人SP-B 1580C/T基因多态性对肺炎模型的易感性差异及潜在机制 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 肺表面活性蛋白B(SP-B)在肺部疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文一 Three types of cell death and differential susceptibility of humanizedtransgenic surfactant protein B (SP-B) variants and wild type FVB/Nmice in Pseudomonas aeruginosa induced pneumonia mod |
| 英文论文二 Clinical study of voriconazole combined with caspofungin or micafungin for invasive pulmonary aspergillus in ICU mechanical ventilation patients |
（4）习得性无助动物模型的改进及其多巴胺机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 习得性无助起源和早期发展 |
| 1.1.1 习得性无助的起源 |
| 1.1.2 早期习得性无助动物模型 |
| 1.1.3 早期习得性无助理论 |
| 1.2 习得性无助的神经机制及反思 |
| 1.2.1 习得性无助的神经机制 |
| 1.2.2 习得性无助理论的反思 |
| 1.3 多巴胺系统 |
| 1.3.1 多巴胺的功能概述 |
| 1.3.2 多巴胺与强化学习 |
| 1.3.3 多巴胺与应激 |
| 1.4 经典习得性无助与多巴胺的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第2章 习得性无助动物模型的改进 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器与设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验设计 |
| 2.3.2 模型制备 |
| 2.3.3 行为测试 |
| 2.3.4 ELISA测定血清皮质酮含量 |
| 2.3.5 数据统计与分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 负强化学习范式的建立 |
| 2.4.2 LOC模型的建立 |
| 2.4.3 完全丧失控制导致更严重的逃避缺陷 |
| 2.4.4 完全丧失控制小鼠产生抑郁样行为 |
| 2.4.5 获得控制避免电击的伤害 |
| 2.4.6 不完全丧失控制小鼠未表现出逃避缺陷和抑郁样行为 |
| 2.4.7 控制和丧失控制不调节小鼠的应激反应 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 负强化学习范式的建立 |
| 2.5.2 负强化学习获得控制,消退学习丧失控制 |
| 2.5.3 丧失控制导致小鼠无助 |
| 2.5.4 LOC模型是一个真正的小鼠“习得性无助”模型 |
| 2.5.5 获得控制产生保护和“免疫”效应 |
| 2.5.6 控制和丧失控制不调节小鼠的应激反应 |
| 2.5.7 LOC模型作为心理应激引起抑郁的动物模型可以用于研究抑郁症 |
| 第3章 丧失控制调节SNc多巴胺神经元活动 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验仪器与设备 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验溶液配制 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 实验内容 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验设计 |
| 3.3.2 模型制备 |
| 3.3.3 穿梭箱测试 |
| 3.3.4 基因鼠DNA鉴定 |
| 3.3.5 在体电生理记录 |
| 3.3.6 离体电生理记录 |
| 3.3.7 立体定位手术 |
| 3.3.8 多通道光纤记录 |
| 3.3.9 光纤记录相关的行为实验 |
| 3.3.10 组织形态学鉴定 |
| 3.4 数据统计与分析 |
| 3.4.1 在体电生理数据分析 |
| 3.4.2 离体电生理数据分析 |
| 3.4.3 光纤记录数据分析 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 丧失控制增加SNc脑区多巴胺神经元自发活动水平 |
| 3.5.2 丧失控制增加SNc脑区多巴胺神经元的内在兴奋性 |
| 3.5.3 基因鼠基因型鉴定 |
| 3.5.4 丧失控制导致小鼠SNc多巴胺神经元对奖赏诱发的反应性降低 |
| 3.5.5 多巴胺动态编码负强化学习过程 |
| 3.6 讨论 |
| 3.6.1 丧失控制导致SNc脑区多巴胺神经元基础活动增强,对奖赏诱发的反应性减小 |
| 3.6.2 多巴胺异常活动是心理应激导致抑郁发生的重要机制 |
| 3.6.3 SNc脑区多巴胺神经元动态编码负强化学习过程 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间科研成果 |
（5）慢性肉芽肿病记忆B细胞数量变化机制及常染色体显性遗传高IgE综合征临床、分子特征研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 慢性肉芽肿病通过滤泡辅助T细胞调节记忆B细胞数量变化的研究 |
| 前言 |
| 第一节 CGD患者记忆B细胞及滤泡辅助T细胞数量变化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 第二节 gp91phox KO小鼠功能鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 第三节 gp91phox KO小鼠记忆B细胞及滤泡辅助T细胞数量变化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 常染色体显性遗传高IgE综合征的临床表现及分子特征 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间研究成果及发表论文 |
（6）芳香烃受体介导NLRP3炎症小体信号通路在苯致造血损伤中的作用机制研究及逆转对策（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一章 芳香烃受体介导NLRP3信号传导通路在苯致造血衰竭中作用机制研究及逆转对策 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 一、BMF建模组小鼠体重随苯注射次数增加而减轻 |
| 二、BMF建模组小鼠血常规、网织红细胞、股骨病理改变 |
| 三、苯诱导BMF小鼠BMMNCs的NLRP3及ROS、CD4+T细胞的改变 |
| 四、BMF小鼠AhR和CYP1A1的表达、凋亡、细胞周期的改变 |
| 五、EPS治疗改善了 BMF组小鼠的体重减轻和造血抑制 |
| 六、EPS治疗通过下调BAX发挥抗调亡作用 |
| 七、EPS通过上调CDK4缓解S期阻滞 |
| 八、EPS抑制NLRP3炎性小体和减轻ROS的产生 |
| 九、EPS增加CD4+T细胞及调节相关造血因子的失衡 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 芳香烃受体介导NLRP3信号传导通路在苯致白血病中作用机制研究及逆转对策 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| —、采用吸入法成功建立BZ-AML小鼠模型 |
| 二、BZ~AML组小鼠表现与人类相似的骨髓白血病免疫表型特征 |
| 三、BZ-AML组小鼠外周血T淋巴细胞功能受抑制 |
| 四、BZ-AML组小鼠BMMNCs及骨髄组织NLRP3表达明显增高 |
| 五、BZ~AML组小鼠BMMNCs存在凋亡受抑制、G0/G1期阻滞 |
| 六、BZ-AML组小鼠股骨组织的NRF2活性增强 |
| 七、Brusatol通过诱导调亡发挥抗白血病作用 |
| 八、Brusatol抑制BZ~AML组小鼠体内NLRP3炎症小体的活化 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要科研成果及获得荣誉 |
| 附件1 |
| 附件2 |
| 附件3 |
| 附件4 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附录 |
（7）齐多夫定对小鼠糖尿病的诱导作用及青蒿琥酯的干预作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 糖尿病动物模型 |
| 一、1型糖尿病动物模型 |
| 二、2型糖尿病动物模型的建立 |
| 三、检测指标 |
| 第二节 糖尿病发生相关机制研究进展 |
| 第三节 中医治疗糖尿病的研究进展 |
| 第四节 齐多夫定药物毒副作用的研究进展 |
| 第五节 青蒿素对疟疾外疾病治疗作用的相关研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 不同剂量AZT对小鼠糖耐量异常诱导作用研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二节 AZT结合高脂饮食研制小鼠糖尿病模型 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三节 青蒿琥酯和二甲双胍对本糖尿病模型的治疗作用研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 结语 |
| 本研究创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（8）CUL4B缺失增强髓源抑制细胞促瘤能力的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 问题的提出 |
| 3 课题意义 |
| 4 论文结构 |
| 第一部分 CUL4B缺失增强髓源抑制细胞促瘤潜力 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 CUL4B调控MDSCs的非T细胞依赖性促瘤能力 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 CUL4B通过调控IL-6/ STAT3通路促进肿瘤细胞干性 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 综述: STAT3在肿瘤微环境细胞群中的作用 |
| 参考文献 |
| 英文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）基于pink1基因探讨补阴牵正方对帕金森病线粒体的保护机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 上篇 文献综述 |
| 综述一 帕金森病相关基因与线粒体功能障碍的研究进展 |
| 概述 |
| 1 线粒体功能障碍与PD |
| 2 PD相关基因和线粒体功能障碍 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 帕金森病模型的研究进展 |
| 概述 |
| 1 建立PD模型常用的细胞株和动物 |
| 2 构建环境因素诱发PD模型的常用药物 |
| 3 构建遗传性PD模型的相关基因 |
| 4 构建环境和遗传因素相互作用PD模型的探索 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 下篇 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基于pink1探讨补阴牵正方对PD细胞模型线粒体质量的影响 |
| 参考文献 |
| 实验一 SH-SY5Y细胞pink1基因过表达模型构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 补阴牵正方对pink1基因过表达PD细胞模型线粒体形态和功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 补阴牵正方对pink1基因过表达PD细胞模型线粒体分裂/融合的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于pink1探讨补阴牵正方对PD模型脑线粒体质量的影响 |
| 实验四 C57BL/6J小鼠脑pink1过表达模型构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 补阴牵正方对脑pink1过表达PD小鼠的防治作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 补阴牵正方对脑pink1过表达PD小鼠脑线粒体形态和功能的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验七 补阴牵正方对脑pink1过表达PD小鼠脑线粒体分裂/融合的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）内侧缰核到脚间核通路乙酰胆碱及其alpha5亚型受体功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 缰核到脚间核神经环路 |
| 1.1.1 缰核到脚间核神经环路的连接 |
| 1.1.2 MHb-IPN的行为功能 |
| 1.1.3 MHb-IPN通路与精神疾病 |
| 1.2 MHb-IPN与恐惧反应相关行为 |
| 1.3 尼古丁成瘾与胆碱能神经元及其受体 |
| 1.3.1 尼古丁的广泛影响 |
| 1.3.2 胆碱能神经系统 |
| 1.3.3 尼古丁受体 |
| 1.3.4 尼古丁成瘾神经环路 |
| 1.3.5 尼古丁受体α5亚基与尼古丁成瘾 |
| 1.4 尚未解决的问题 |
| 1.4.1 MHb亚核团特异性控制恐惧记忆行为 |
| 1.4.2 尼古丁摄入量与IPN CHRNA5 基因表达水平的关系 |
| 1.4.3 IPN CHRNA5 神经元在大鼠尼古丁成瘾行为中发挥的作用 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 转基因动物构建及验证 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 转基因载体制备引物 |
| 2.1.3 胚胎培养注射及移植 |
| 2.1.4 转基因动物基因型鉴定 |
| 2.1.5 转基因动物表达分析(RNA荧光原位杂交,RNA-FISH) |
| 2.2 大鼠IPN基因表达水平检测 |
| 2.3 MHb损毁及行为实验 |
| 2.3.1 神经元损毁 |
| 2.3.2 条件恐惧实验 |
| 2.3.3 高架十字迷宫实验 |
| 2.3.4 社交实验 |
| 2.3.5 气味辨别实验 |
| 2.3.6 T-迷宫 |
| 2.3.7 糖水偏好实验 |
| 2.3.9 长时程旷场实验 |
| 2.4 大鼠尼古丁自给药实验 |
| 2.4.1 实验动物 |
| 2.4.2 药品 |
| 2.4.3 实验设备 |
| 2.4.4 手术及护理 |
| 2.4.5 大鼠尼古丁成瘾行为训练和测试 |
| 第3章 MHb调控小鼠的恐惧记忆消退及其他情绪性行为 |
| 3.1 敲除MHb高表达基因影响小鼠的恐惧记忆消退 |
| 3.2 MHb神经元控制小鼠恐惧记忆消退 |
| 3.2.1 细胞遗传学方法损毁腹侧MHb ChAT神经元 |
| 3.2.2 腹侧MHb ChAT神经元损毁减缓小鼠恐惧记忆消退 |
| 3.2.3 背侧MHb神经元损毁加快小鼠的恐惧记忆形成 |
| 3.2.4 直接激活IPN加快小鼠恐惧记忆消退 |
| 3.2.5 dorsal MHb与 Ventral MHb有不同的神经输入 |
| 3.3 MHb神经元参与小鼠其他情绪性行为 |
| 3.3.1 Ventral MHb ChAT神经元损毁影响小鼠对新环境的适应能力 |
| 3.3.2 Ventral MHb ChAT神经元损毁降低小鼠焦虑水平 |
| 3.3.3 Ventral MHb ChAT神经元损毁影响小鼠的气味分辨 |
| 3.3.4 Ventral MHb ChAT神经元损毁影响社交行为 |
| 3.3.5 Ventral MHb ChAT神经元损毁影响认知行为 |
| 3.3.6 Ventral MHb ChAT神经元损毁不影响小鼠奖赏行为 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 IPNα5尼古丁受体亚型与尼古丁成瘾 |
| 4.1 CHRNA5-CRE敲入转基因小鼠构建 |
| 4.1.1 CHRNA5-CRE敲入转基因小鼠构建策略 |
| 4.1.2 CHRNA5-CRE敲入转基因小鼠表达验证 |
| 4.2 CHRNA5-CRE基因表达水平与尼古丁成瘾的关系 |
| 4.2.1 CHRNA5 基因表达水平与大鼠尼古丁成瘾成正相关 |
| 4.2.2 长时程尼古丁给药不会改变CHRNA5 及其他尼古丁受体基因表达水平 |
| 4.3 尼古丁可以激活IPN CHRNA5 神经元 |
| 4.3.1 尼古丁可以强烈激活IPN c-fos表达 |
| 4.4 CHRNA5 神经元活动控制大鼠尼古丁摄入量 |
| 4.4.1 化学遗传学激活CHRNA5 神经元增加尼古丁摄入量 |
| 4.4.2 化学遗传学抑制CHRNA5 神经元减少尼古丁摄入量 |
| 4.4.3 CNO不影响对照组大鼠尼古丁摄入 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 MHb在恐惧行为中的作用 |
| 5.2 IPN在尼古丁成瘾中的作用 |
| 5.2.1 大鼠CHRNA5 基因敲除策略 |
| 5.2.2 大鼠α5 nAChRs电生理特性 |
| 5.2.3 IPNα5 nAChRs行为学效应 |
| 5.3 MHb-IPN参与调控的其他行为 |
| 5.4 研究总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
四、Fv-4基因杂合子小鼠对Fr.MuLV感染的敏感性差异的分析（论文参考文献）
- [1]FoxO1在大口黑鲈糖脂代谢中的机制研究[D]. 陈沛. 中国农业科学院, 2021
- [2]基于GAT-2探讨抑郁症肝郁脾虚证及逍遥散干预机制[D]. 童萍. 扬州大学, 2021
- [3]人SP-B基因1580C/T多态性与铜绿假单胞菌肺炎致肺损伤易感性的研究[D]. 张静. 山东大学, 2020(04)
- [4]习得性无助动物模型的改进及其多巴胺机制研究[D]. 尧丽. 陕西师范大学, 2020(02)
- [5]慢性肉芽肿病记忆B细胞数量变化机制及常染色体显性遗传高IgE综合征临床、分子特征研究[D]. 向青青. 重庆医科大学, 2020(01)
- [6]芳香烃受体介导NLRP3炎症小体信号通路在苯致造血损伤中的作用机制研究及逆转对策[D]. 贺今. 山东大学, 2019(02)
- [7]齐多夫定对小鼠糖尿病的诱导作用及青蒿琥酯的干预作用研究[D]. 杨万斌. 广州中医药大学, 2019(08)
- [8]CUL4B缺失增强髓源抑制细胞促瘤能力的机制研究[D]. 许志亮. 山东大学, 2019(02)
- [9]基于pink1基因探讨补阴牵正方对帕金森病线粒体的保护机制[D]. 强天遥. 北京中医药大学, 2019(04)
- [10]内侧缰核到脚间核通路乙酰胆碱及其alpha5亚型受体功能[D]. 谭禄彬. 清华大学, 2018(04)