一种用于结肠炎修复的高流变性25-羟基维生素D3制剂论文和设计-王宝维

全文摘要

本发明提供一种组合物，所述的组合物包含有鸭油甘油二酯和25OHVD3；所述的鸭油甘油二酯和25OHVD3的质量比为1:1.5～3.0(g\/μg)；本发明的组合物用于制备治理生态结肠炎的修复制剂。本发明还提供一种结肠炎的修复制剂，是使用上述的组合物制备的；其一种具体制备方法，是将鸭油甘油二酯溶解，调整温度范围为25～40℃；按鸭油甘油二酯和25OHVD3的质量比g\/μg为1:1.5～3.0将两者进行混合，搅拌时间为0.5～2min完成制备。本发明的组合物对结肠炎大鼠具有改善生理指标，降低TNF‑α、IL‑6肠道炎症因子，降低D‑LA以减弱肠道内毒素的产生和细菌移位，调节肠道菌群。有望开发一种新型高效的治疗溃疡性结肠炎的保健品。

主设计要求

1.一种组合物，其特征在于，所述的组合物包含有鸭油甘油二酯和25OHVD3。

设计方案

1.一种组合物，其特征在于，所述的组合物包含有鸭油甘油二酯和25OHVD_3<\/sub>。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的鸭油甘油二酯和25OHVD_{3<\/sub>的质量比g\/μg为1:1.5～3.0。}

3.权利要求1或2所述的组合物在制备结肠炎修复制剂中的应用。

4.一种结肠炎的修复制剂，其特征在于，所述的修复制剂是使用权利要求1或2所述的组合物制备的。

5.如权利要求4所述的结肠炎的修复制剂，其特征在于，所述的修复制剂的制备方法，是将鸭油甘油二酯溶解，调整温度范围为25～40℃；按鸭油甘油二酯和25OHVD_{3<\/sub>的质量比g\/μg为1:1.5～3.0将两者进行混合，搅拌时间为0.5～2min完成制备。}

6.权利要求4所述的结肠炎的修复制剂在制备防治溃疡性肠炎的制品中的应用。

设计说明书

技术领域

本发明属于肠炎治疗制剂技术领域，具体涉及一种用于结肠炎修复的高流变性25-羟基维生素D_{3<\/sub>制剂。}

背景技术

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，又称慢性非特异性溃疡性结肠炎，是以直、结肠的表浅性、非特异性炎症病为主，同时容易诱发肠外多器官损伤的一种疾病。该病多发生欧美国家高于亚洲，在我国发生率不高因此重视不够，近年来患病率逐年增多。

结肠炎是一种原因不明的疑难杂症，可由多种因素引起，例如长期大量饮酒等不良饮食习惯、自身免疫系统紊乱、吸烟环境甚至情绪刺激等都容易导致结肠炎，其中以自身免疫为根本。结肠炎临床表现为腹泻、腹痛、黏液便及脓血便，常伴有消瘦乏力等，有传染性，病程冗长，多反复发作折磨患者。近年来我国溃疡性结肠炎发病呈上升趋势，常见于各个年龄段人群，在发病初期并不会影响人们的生活引起人们的重视，导致发现结肠炎时已经较难治愈。结肠活动度较大，连接盲肠、胰腺、盆腔、输尿管等重要部位，手术治疗困难较大，因此结肠的保护应该引起人们足够的重视。另外，由于饲料霉菌和大肠杆菌感染等原因，造成畜禽溃疡性结肠炎现象也较多，由于在肠道后段药物有效浓度降低较大，采用抗生素治疗也很难治愈，为此，给畜禽养殖造成很大损失。

目前，临床上用于溃疡性结肠炎的药物较多，抗酸剂、质子泵抑制剂、H2-受体拮抗剂等是目前国内抗消化性溃疡的主要药物，但这些药物在肠道后端容易失效且一般都存在不同程度的不良反应和药物残留，并且愈后复发率高，对消化性溃疡不能取得满意的治疗效果。因此，长期以来人们非常重视研究与开发治疗消化道溃疡性疾病的治疗药物，其对于减少药物残留、提高药效，改善患者的生活质量具有十分重要意义。

发明内容

本发明提供了一种生态结肠炎修复制剂，即一种用于结肠炎修复的高流变性25-羟基维生素D_{3<\/sub>制剂，使用鸭油甘油二酯、25羟基维生素D_{3<\/sub>(25HVD_{3<\/sub>)组合物用于抑菌、调节溃疡性肠炎肠道免疫及微生物体系；从而弥补现有技术的不足。}}}

本发明首先提供一种组合物，所述的组合物包含有鸭油甘油二酯和25OHVD_3<\/sub>；

所述的鸭油甘油二酯和25OHVD_{3<\/sub>的质量比为1:1.5～3.0(g\/μg)；}

本发明的组合物用于制备治疗溃疡性结肠炎的修复制剂。

本发明还提供一种结肠炎的修复制剂，是使用上述的组合物制备的；其具体制备方法，是将鸭油甘油二酯溶解，调整温度范围为25～40℃；按鸭油甘油二酯和25OHVD_{3<\/sub>的质量比g\/μg为1:1.5～3.0将两者进行混合，搅拌时间为0.5～2min完成制备。}

本发明的组合物对结肠炎大鼠具有改善生理指标，降低TNF-α、IL-6肠道炎症因子，降低D-LA以减弱肠道内毒素的产生和细菌移位，调节肠道菌群。有望开发一种新型高效的治疗溃疡性结肠炎的保健品。

附图说明

图1：不同油脂的流变特性图；

图2：不同处理水平下大鼠肠道菌群Beta多样性分析图，其中Colon3：Ⅲ组(修复组)；Colon4：Ⅳ组(修复组)；Colon5：Ⅴ组(修复组)；Colon6：Ⅵ组(修复组)；Colon7：Ⅶ组(修复组)；Colon8：Ⅷ组；ColonD(正常组)，ColonM(模型炎症组)；

图3：最佳水平组合物对大肠杆菌形态学变化图，其中A：空白对照组(×15,000)；B：大豆油组(×15,000)；C：组合物组(×15,000)；D：恩诺沙星组(×15,000)；

图4：最佳水平组合物对沙门氏菌形态学变化图，其中A：空白对照组(×15,000)；B：大豆油组(×15,000)；C：组合物组(×15,000)；D：恩诺沙星组(×15,000)；

图5：最佳组合物对金黄色葡萄球菌形态学变化图。

图6：最佳组合物对表皮葡萄球菌形态学变化图。

具体实施方式

甘油二酯是甘油三酯的脂肪酸被取代的结构脂质，具有脂类的溶解脂溶性维生素的性质，是公认安全(GRAS)的食品成分，具有降血脂、减肥，提高溶解度和液体稳定性等功能。已知通过酶法可从鸭油中提取出鸭油甘油二酯。本发明将维生素D_{3<\/sub>的体内活性形式25-羟基维生素D_{3<\/sub>(25-OH-VD_{3<\/sub>)和溶剂鸭油甘油二酯联合使用，能有效的抑菌、抑制炎症因子的释放和调节肠道菌群结构。}}}

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：鸭油甘油二酯的流变特性测定

将鸭油、大豆油、鸭油甘油二酯和猪油倒入烧杯中，使用流变仪进行检测，剪切速率：2.509-100\/s，温度25℃。

由图1可看出，鸭油、大豆油、鸭油甘油二酯的剪切应力无显著差异，而猪油的剪切应力与三者相比较显著增加，表明鸭油甘油二酯的流变特性较好。

实施例2：组合物的配合

本发明中鸭油甘油二酯的溶解温度范围为25～40℃；质量比：鸭油甘油二酯1g，25羟基维生素D_{3<\/sub>1.5～3.0μg。两者混合搅拌时间为0.5～2min。}

实施例3：组合物的效果检测

试验动物及分组：试验分为两个阶段进行：

第一阶段：结肠炎模型建立。分为模型组和对照组，对照组2个重复，模型组16个重复，每个重复5只，共100只大鼠；模型组大鼠每日饮用5％葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液，连续7天，对照组饲喂蒸馏水。

造模结束后，模型组和对照组各抽取10只大鼠，禁食12h，取血清及各器官，并检测生长指标和血液生化指标，即验证模型建立是否成功。

第二阶段：鸭油甘油二酯与25OHVD_{3<\/sub>协同对结肠炎大鼠干预效果试验}

选择第一阶段建模成功的大鼠70只，随机分成7个试验组，分别为模型组和处理组。另选取10只正常大鼠作对照组。每组2个重复，每个重复5只，饲喂情况如表1所示。

表1：鸭油甘油二酯与25OHVD_{3<\/sub>协同对大鼠干预效果试验设计}

取材及处理：禁食24h，称量每只大鼠的体重。大鼠眼眶取血后脱颈处死，血液4℃、3000r\/min离心15min，取上清液放入1.5mL离心管中，-40℃冰箱保存以待检测；解剖大鼠，取结肠、脾，4℃生理盐水洗净，称量结肠、脾长短和重量。脏器和血液放入-80℃冰箱中保存以待检测。

检测指标：

1)称量每只大鼠的体重、结肠长短、脾长度和重量。

2)按照试剂盒测定TNF-α、IL-6、D-LA含量。

3)采用16SrRNA测序技术，基于Illumina HiSeq测序平台，利用双末端测序(Paired-End)的方法对结肠微生物菌群结构和菌群数量进行测定。

试验结果：

1)各组对溃疡性肠炎大鼠生理生长的影响

给药后各组大鼠的生理指标的变化见表2，与正常组相比，模型组大鼠体重、结肠长度显著降低、脾重、脾长显著增加，说明肠炎导致大鼠体内消化吸收不良，体重降低，结肠变短，免疫器官过度应答，脾长、脾重增加。与模型组相比，处理组(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ)均显著增加体重、结肠长度，显著降低脾重、脾长，说明组合物有显著的修复炎症的作用。

表2：鸭油甘油二酯与25OHVD_{3<\/sub>协同对肠炎大鼠生理指标的影响}

2)各组对溃疡性肠炎大鼠炎症因子、肠道通透性的影响

给药后各组大鼠的生理指标的变化见表3，与正常组相比，模型组大鼠血清的TNF-α、IL-6、D-LA显著增加，说明肠炎有明显促进大鼠体内炎症因子、通透性因子上升的作用。与模型组相比，处理组(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ))均显著降低血清炎症因子和内毒素通透性，说明组合物有显著的修复炎症的作用。

表3：鸭油甘油二酯与25OHVD_{3<\/sub>协同对肠炎大鼠炎症因子、肠道通透性的影响}

3)4.1Alpha多样性分析

在97％相似度水平下，各样品Alpha多样性指数值统计如下表4所示。Alpha多样性反应的是物种丰度及多样性，其中物种丰度主要有OUTs、Ace、Chao来表示，多样性由Shannon指数来表示。本试验结果发现，模型组大鼠结肠菌群的OTU数量、Ace指数、Chao指数及Shannon指数均小于正常组且有显著性差异。给予肠道保护剂后，大鼠结肠菌群的OTU数量、Ace指数、Chao指数及Shannon指数增大，说明DSS诱导肠道炎症降低大鼠肠道菌群的丰度和多样性，添加肠道保护剂后，使肠炎大鼠肠道菌群丰度和多样性增加，恢复正常。以上结果表明，与正常组大鼠比较，模型组大鼠肠道细菌出现多样性减少及细菌基因丰度改变，给予组合物后肠道微生物多样性得到一定程度的改善。各组结肠内容物菌群的Coverage指数均在0.998以上，因此，样品测序质量较高，未被检测到的可能性极低。

表4：不同水平下大鼠结肠菌群Alpha多样性分析

4)Beta多样性分析

为了进一步展示样品间物种多样性的比较，采用主成分分析(PrincipalComponent Analysis)的方法展示样品间的多样性分析。如图2所示，主坐标分析图健康对照组和肠炎组沿主坐标的细菌组合之间清晰的接线，PCA图显示组合物处理后的肠炎小鼠与DSS模型组小鼠有明显差异，且Ⅳ(4)组主成分与健康对照组相似。结果表明，组合物能使DSS诱导的肠道菌群主成分分析朝正常对照组恢复，调节了肠道菌群的失衡。

图2是不同水平下大鼠肠道菌群Beta多样性分析图，其中横坐标表示第一主成分，对样品差异的8.52％的贡献值；纵坐标表示第二主成分，对样品差异的17.03％的贡献值。colonD:结肠对照组、colonM:结肠模型组

实施例4：鸭油甘油二酯-25OHVD_{3<\/sub>对溃疡性结肠炎大鼠肠道微生物群落在门、纲分类水平的影响}

表5：鸭油甘油二酯-25OHVD_{3<\/sub>协同对溃疡性结肠炎大鼠肠道菌群门水平物种组成的影响}

表5显示的是鸭油甘油二酯-25OHVD_{3<\/sub>不同水平对肠炎大鼠结肠微生物门水平优势菌门的影响。在相似度97％的情况下，计算结肠微生物门水平优势菌群含量。其中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)为主要的优势菌门。}

厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度在Ⅰ组最低，在Ⅱ组最高，Ⅱ组与Ⅰ组相比显著升高(P＜0.05)。处理组Ⅲ-Ⅷ组与Ⅱ组相比均显著性降低(P＜0.05)，其中Ⅳ组比其它五组均低，与Ⅰ组较接近。拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度在Ⅰ组最高，在Ⅱ组最低，Ⅱ组与Ⅰ组相比显著降低(P＜0.05)。处理组Ⅲ-Ⅷ组与Ⅱ组相比均显著性升高(P＜0.05)，其中Ⅳ组显著高于其他处理组(P＜0.05)。变形菌门(Proteobacteria)相对丰度在Ⅰ组最低，在Ⅱ组最高，Ⅱ组与Ⅰ组相比显著升高(P＜0.05)。处理组Ⅲ-Ⅷ组与Ⅱ组相比均显著性降低(P＜0.05)，其中Ⅳ组低于其它四组。

结果表明，加入甘油二酯-25OHVD_{3<\/sub>后致病菌厚壁菌门和变形菌门相对丰度变低，有益菌拟杆菌门相对丰度变高，组合物对肠道菌群结构具有有益调节作用，其中Ⅳ组效果最好。}

表6：鸭油甘油二酯-25OHVD_{3<\/sub>协同对溃疡性结肠炎大鼠肠道菌群纲水平物种组成的影响}

表6显示的是鸭油甘油二酯-25OHVD_{3<\/sub>不同水平对肠炎大鼠结肠微生物纲水平优势菌门的影响。在相似度97％的情况下，计算结肠微生物纲水平下优势菌群含量。其中拟杆菌纲(Bacteroidia)；梭状芽孢杆菌纲(Clostridia)；丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)；丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)为主要的优势菌纲。}

拟杆菌纲(Bacteroidia)相对丰度在Ⅰ组最高，在Ⅱ组最低，Ⅱ组与Ⅰ组相比显著降低(P＜0.05)。处理组Ⅲ-Ⅷ组与Ⅱ组相比均显著性升高(P＜0.05)，其中Ⅳ组比其它五组均高，与Ⅰ组较接近。梭状芽孢杆菌纲(Clostridia)相对丰度在Ⅱ组最高，在Ⅰ组最低，各组之间无显著性差异(P＞0.05)。丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)相对丰度在Ⅰ组最低，在Ⅱ组最高，Ⅱ组与Ⅰ组相比显著升高(P＜0.05)。处理组Ⅲ-Ⅷ组与Ⅱ组相比均显著性降低(P＜0.05)，其中Ⅳ组低于其它四组。丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)相对丰度在Ⅰ组最低，在Ⅱ组最高，Ⅱ组与Ⅰ组相比显著升高(P＜0.05)。处理组Ⅲ-Ⅷ组与Ⅱ组相比均显著性降低(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ组与Ⅰ组无显著差异(P＞0.05)，其中Ⅳ组低于其它三组与对照组较接近。

结果表明，加入甘油二酯-25OHVD_{3<\/sub>后有益菌拟杆菌纲相对丰度变高，致病菌丙型变形菌纲和丹毒丝菌纲相对丰度变低，组合物对肠道菌群结构具有有益调节作用，其中Ⅳ组效果最好。}

实施例5：鸭油甘油二酯-25OHVD_{3<\/sub>对体外抑菌效果观察}

用扫描电镜(SEM)观察组合物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌形态的影响。空白菌体组和大豆油组作为阴性对照组，恩诺沙星作为阳性对照组。首先分别取上述试验组与对照组的菌悬液各2mL于离心管中，4000r\/min下离心5min收集菌体。然后用4％戊二醛溶液来固定菌体细胞4h，用PBS洗涤残留的戊二醛，50％、70％、90％、100％梯度体积分数乙醇分别脱水来处理菌体15min。最后将脱水后的菌体涂布于干净的铜台上，自然风干后，用溅射仪对菌体进行表面镀金，将样品放入电镜室后，对样品室进行放气，抽到高真空1.0×10^{-3<\/sup>Pa后，扫描电镜观察菌体表面形态。}

从图3可看出未经处理的细菌(图3A)和大豆油处理(图3B)的大肠杆菌形态，具有完整性的短棒状形状，膜结构完整，细胞表面平滑。组合物处理后明显破坏了细菌细胞的表面结构和形态(图3C)，细菌细胞形态缩小，细胞完整性丧失，与药物处理组相接近(图3D)。表明，组合物对大肠杆菌细胞膜有损伤作用。

从图4可看出，未经处理的细菌(图4A)和大豆油处理(图4B)的沙门氏菌形态，长杆状，膜结构完整，质地光滑。组合物处理后明显破坏了细菌细胞的表面结构和形态(图4C)，细菌细胞形态缩小，细胞完整性丧失,与药物处理组相接近(图4D)。表明，组合物对沙门氏菌细胞膜有损伤作用。

从图5可看出，未经处理的细菌(图5A)和大豆油处理(图5B)的金黄色葡萄球菌形态，呈球形，膜结构完整，质地光滑。组合物处理后明显破坏了细菌细胞的表面结构和形态(图5C)，细菌细胞形态缩小，细胞完整性丧失，与药物处理组相接近(图5D)。表明，组合物对金黄色葡萄球菌细胞膜有损伤作用。

从图6可看出，未经处理的细菌(图6A)和大豆油处理(图6B)的表皮葡萄球菌形态，圆柱形，膜结构完整，纹理光滑。组合物处理后明显破坏了细菌细胞的表面结构和形态(图6C)，细菌细胞形态缩小，细胞完整性丧失，与药物处理组相接近(图6D)。表明，组合物对表皮葡萄球菌细胞膜有损伤作用。

本发明将鸭油甘油二酯与25OHVD_{3<\/sub>组合制成修复剂，可以破坏细菌细胞结构，抑制细菌生长；进行溃疡性肠炎的修复，显著降低炎症因子的释放，降低肠道通透性从而减少内毒素的释放和细菌移位，调节肠道菌群，减少肠道致病菌，对溃疡性结肠炎有较好的修复效果。}

设计图

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