在Ⅰ型干扰素反应细胞中特异敲除RACK1对造血干细胞的影响

论文摘要

目的:利用干扰素诱导型MX-Cre在Ⅰ型干扰素反应细胞中特异敲除含有7个WD40 repeat的接头蛋白RACK1（基因名Gnb2l1）,分析这种小鼠模型对病毒的抗感染能力如何。通过流式细胞术检测并分析在Ⅰ型干扰素反应细胞中特异敲除RACK1对造血干细胞、各谱系造血祖细胞的影响,分析RACK1缺失对造血干细胞的凋亡及增殖的影响。通过蛋白-蛋白相互作用分析探讨RACK1调控造血干细胞的分子机制。方法:1.在Ⅰ型干扰素反应细胞中敲除RACK1的小鼠模型,用Gnb2l1F/F,MX-Cre表示,对照小鼠用Gnb2l1F/F表示,课题组前期工作已经建立相应模型。在正式实验开始前,剪鼠尾鉴定基因型,以区分Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠和Gnb2l1F/F小鼠。Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠和Gnb2l1F/F小鼠腹腔注射Poly（I:C）,以实现Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠的体内诱导敲除。并通过WB鉴定在蛋白水平上是否敲除。2.腹腔注射Poly（I:C）后,Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠和Gnb2l1F/F小鼠尾静脉注射VSV,后取小鼠外周血以得到血清,检测血清中的IFNβ。取肺和肝并称重,分别计算肺/体重和肝/体重。通过流式细胞术检测Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠和Gnb2l1F/F小鼠脾和肝中I型干扰素主要产生细胞pDC和髓系细胞的表达情况。3.取小鼠股骨骨髓,通过流式细胞术分选造血干细胞、巨核细胞/红细胞系祖细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞、髓系细胞祖细胞、淋巴细胞系祖细胞和B淋巴细胞、髓系细胞、红系细胞,通过Real-Time PCR检测各个阶段RACK1、c-Myc及N-Myc的基因表达水平,并通过多色荧光组化分析RACK1与造血干细胞的表面标记CD117是否为共定位关系。Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠及Gnb2l1F/F小鼠股骨石蜡切片进行HE染色分析骨髓的病理损伤情况。通过流式细胞术分析Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠和Gnb2l1F/F小鼠的造血干细胞、各谱系造血祖细胞比例和绝对数,RACK1缺失对造血干细胞的凋亡及增殖的影响。制备嵌合体小鼠验证上述变化是否由于细胞的内在缺陷所引起。流式细胞术检测Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠和Gnb2l1F/F小鼠造血干细胞中c-Myc和N-Myc的表达量,并给小鼠腹腔注射Myc inhibitor进行逆转实验。为接下来的机制探讨提供基础。4.基于上述实验基础,进行体外实验,免疫共沉淀（CO-IP）分析c-Myc、N-Myc分别与RACK1是否有相互作用。使用纯化的GST及GST-RACK1直接pull down,分析是否为两者的直接相互作用。纯化Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠及Gnb2l1F/F小鼠造血干细胞,沉淀c-Myc或N-Myc,来分析E3泛素连接酶Fbxw7在其中产生的作用。结果:1.小鼠基因型鉴定成功。Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠在Poly（I:C）诱导后蛋白水平上也实现敲除。2.VSV感染后,与Gnb2l1F/F小鼠相比,Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠血清中的IFNβ水平降低,肝肺湿重/体重比值有增高趋势。流式细胞术检测结果显示Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠肝脾中Ⅰ型干扰素主要产生细胞pDC明显少于Gnb2l1F/F小鼠,并且髓系细胞也明显低于Gnb2l1F/F小鼠。3.Real-Time PCR结果显示,在mRNA转录水平上,造血干细胞、各谱系造血祖细胞及成熟阶段细胞都含有RACK1、c-Myc和N-Myc。从数据上来看,幼稚阶段表达水平明显高于成熟阶段。通过Gnb2l1F/F小鼠股骨石蜡切片进行多色荧光组化的结果显示RACK1与CD117具有荧光共定位。将Gnb2l1F/F小鼠及Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠股骨石蜡切片进行HE染色分析,在Ⅰ型干扰素反应细胞中特异敲除RACK1使骨髓腔内造血细胞稀少。Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠中造血干细胞、CMP和CLP在细胞比例上和细胞总数上都显著减少,GMP及MEP在绝对数统计结果中有明显降低。HSC的凋亡及增殖在比例上都显著增多。嵌合体小鼠实验证明以上变化是由于小鼠细胞内在缺陷所引起。Ⅰ型干扰素反应细胞中特异敲除RACK1会使HSC中表达c-Myc和N-Myc的细胞比例增多。注射Myc inhibitor可以部分逆转HSC。4.CO-IP结果显示,RACK1与c-Myc、N-Myc之间都有相互作用,并且证明为直接相互作用。纯化的小鼠造血干细胞沉淀c-Myc或N-Myc,结果显示在Ⅰ型干扰素反应细胞中特异敲除RACK1后,c-Myc或N-Myc与E3泛素连接酶Fbxw7的相互作用减弱。结论:1.小鼠模型鉴定成功,区分出Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠和Gnb2l1F/F小鼠;2.在Ⅰ型干扰素反应细胞中特异敲除RACK1使小鼠的抗感染能力减弱;3.在Ⅰ型干扰素反应细胞中特异敲除RACK1使骨髓中的HSC和各谱系造血祖细胞大幅度减少。Gnb2l1F/F,MX-Cre小鼠的HSC凋亡比例显著增加,增殖也大幅增加。制备嵌合体小鼠证实了这种现象为细胞内在缺陷所引起。逆转实验提示我们在Ⅰ型干扰素反应细胞中特异敲除RACK1使骨髓中HSC产生一系列影响是由于c-Myc和N-Myc大量积聚所致;4.RACK1与c-Myc和N-Myc都具有直接相互作用,沉淀c-Myc或N-Myc,在Ⅰ型干扰素反应细胞中特异敲除RACK1后,与c-Myc或N-Myc相互作用的Fbxw7蛋白量减少。c-Myc或N-Myc与Fbxw7相互结合作用减弱,导致c-Myc或N-Myc大量积聚。为以后深入研究RACK1影响HSC的机制提供有利参考。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分：干扰素诱导型RACK1 基因敲除小鼠模型的鉴定
•   1、材料与方法
•     1.1 实验材料
•       1.1.1 实验小鼠
•       1.1.2 实验试剂
•       1.1.3 实验设备
•     1.2 实验方法
•       1.2.1 鼠尾DNA基因型的提取
•       1.2.2 PCR反应体系
•       1.2.3 PCR反应程序
•       1.2.4 琼脂糖凝胶电泳
•       1.2.5 造血干细胞的纯化（阳选）
•       1.2.6 免疫印迹法（Western blotting）
•     1.3 统计学方法
•   2、实验结果
•     2.1 基因敲除小鼠模型的基因型鉴定
•     2.2 基因敲除小鼠模型的蛋白表达量鉴定
•   3、讨论
• 第二部分：小鼠模型对VSV感染反应性的影响
•   1、材料与方法
•     1.1 实验材料
•       1.1.1 实验小鼠
•       1.1.2 实验试剂
•       1.1.3 实验设备
•     1.2 实验方法
•       1.2.1 病毒感染小鼠模型的建立
•       1.2.2 小鼠肝肺湿重及体重
•       1.2.3 分选pDC
•       1.2.4 分离肝脏单个核细胞
•       1.2.5 流式细胞术
•     1.3 统计学方法
•   2、实验结果
•     2.1 ELISA检测IFNβ及肝湿重/体重、肺湿重/体重
•     2.2 小鼠肝、脾中pDC的比例和绝对数
•     2.3 小鼠肝、脾中髓系细胞的比例和绝对数
•   3、讨论
• 第三部分：特异敲除RACK1对HSC的影响分析
•   1、材料与方法
•     1.1 实验材料
•       1.1.1 实验小鼠
•       1.1.2 实验试剂
•       1.1.3 实验设备
•     1.2 实验方法
•       1.2.1 多色荧光组化
•       1.2.2 提取RNA
•       1.2.3 反转录
•       1.2.4 Real-time PCR
•       1.2.6 核内因子染色
•       1.2.7 嵌合体小鼠的制备
•     1.3 统计学方法
•   2、实验结果
•     2.1 Real-Time PCR检测各个阶段的基因表达量并多色荧光组化观察共定位情况
•     2.2 HE染色观察骨髓腔受损情况
•     2.3 流式细胞术检测HSC及各谱系造血祖细胞
•     2.4 .RACK1对HSC凋亡及增殖的影响
•     2.5 在嵌合体小鼠中验证上述结果
•     2.6 RACK1对HSC中的c-Myc和N-Myc的影响
•     2.7 Myc inhibitor对HSC的逆转作用
•   3、讨论
• 第四部分：RACK1影响HSC的机制探讨
•   1、材料与方法
•     1.1 实验材料
•       1.1.1 实验小鼠
•       1.1.2 实验试剂
•       1.1.3 实验设备
•     1.2 实验方法
•       1.2.1 细胞转染
•       1.2.2 免疫共沉淀蛋白样品的收集
•       1.2.3 细胞复苏
•       1.2.4 细胞传代
•       1.2.5 细胞冻存
•       1.2.6 考马斯亮蓝染色及脱色
•     1.3 统计学方法
•   2、实验结果
•     2.1 c-Myc、N-Myc与 RACK1之间存在相互作用
•     2.2 c-Myc、N-Myc与 RACK1之间有直接相互作用
•     2.3 沉淀c-Myc或 N-Myc,在Ⅰ型干扰素反应细胞中特异敲除RACK1后对Fbxw7的影响
•   3、讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述 造血干细胞的发育特性
•   参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐哲

导师: 修冰水,张纪岩

关键词: 造血干细胞

来源: 安徽医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 安徽医科大学

分类号: R329.2

总页数: 96

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