狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株构建及特性研究

论文摘要

狂犬病,一种古老而流行广泛的神经疾病,它影响到差不多所有种类的哺乳动物,包括人类。引起这种疾病的原因是狂犬病病毒（rabies virus,RABV）,它是弹状病毒科,狂犬病病毒属的成员。RABV的基因组长度11927nt,包含5个单顺反子RNAs,分别编码:核蛋白、磷酸化蛋白、基质蛋白、糖蛋白和大蛋白。在这些单顺反子之间是4个长度不相同的基因间隔区,间隔区分别含有2、5、5、423个核苷酸。单股负链的RABV基因组结构相对简单,因此对其基因组的操作会更方便。但是相比于同为弹状病毒科的水泡型口炎病毒,RABV的基因间隔区的碱基序列具有不平衡的特点。RABV基因间隔区的不均衡对病毒到底是怎样的影响,是值得我们思考和研究的问题。本课题运用RABV的反向遗传的操作系统对RABV的CVS-11株的基因间隔区进行遗传改造,构建狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株,并进一步探究该毒株间隔区的缩短对CVS-11株各方面特性的影响。通过对本实验保存的狂犬病病毒弱毒株CVS-11株进行序列测定,对其基因间隔区的碱基进行遗传改造,使得各蛋白间的基因间隔区核苷酸是CT,分4段对其全长进行扩增,然后利用In-fusion技术进行同源重组进而完成重组病毒全长基因组的真核表达载体的构建,用两对特异性的引物经过菌液PCR的扩增鉴定,分别得到1570 bp和850 bp的目的条带,证明同源重组成功。然后将N、P、L及G蛋白4个辅助表达质粒与构建的狂犬病病毒CVS-11间隔区缩短的缺失株的全长质粒共转染BSR-T7细胞系,进行重组病毒拯救,直接免疫荧光检测鉴定,最后于荧光显微镜下我们看到了特异性的荧光,证明狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株得到成功拯救并且能够在BSR-T7细胞系中表达。通过对重组病毒的G、L蛋白的基因之间的间隔区进行RT-PCR得到820bp大小的目的条带,证实狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株在细胞中得到稳定地转录。取重组病毒和原毒株CVS-11的细胞培养物,于透射电镜下均可观察到RABV粒子的典型特征。通过绘制重组病毒和原毒株在不同的病毒感染数时证明,重组病毒的病毒表现出与原毒株相似的复制特点,但重组病毒的滴度低于原毒株。将重组病毒和原毒株分别以1×107TCID50/mL和1×106TCID50/mL的量对小鼠进行外周的肌肉攻毒,10只/组,病毒感染6天后,记录发病和死亡情况。结果显示狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株对小鼠的致死力较强,存活率较低,差异较显著。将1×107。5TCID50/mL的重组病毒和原毒株灭活后加铝佐剂免疫小鼠,10只/组,14天后,眼球采血,分离血清,采用荧光抗体中和试验检测抗体,结果显示狂犬病病毒CVS-11间隔区的缩短对其有影响,但是差异性并不显著。本课题成功构建了狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株并对其生物学特性、免疫原性进行了研究,结果证实了狂犬病病毒CVS-11株间隔区的缩短对原毒株在细胞上的复制以及免疫原性方面没有显著的影响,但是能够增强小鼠的致病力,影响较明显。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 前言
• 第一篇 文献综述
•   第一章 狂犬病及其病原狂犬病病毒的概述
•     1.1 狂犬病简介
•     1.2 狂犬病病毒基因组结构
•     1.3 狂犬病病毒结构蛋白的结构及其功能
•   第二章 反向遗传学研究系统概述
•     2.1 反向遗传学研究系统的研究进展
•     2.2 反向遗传技术在负链RNA病毒的应用
• 第二篇 研究内容
•   第一章 狂犬病病毒CVS-11 株间隔区缩短的缺失株的构建
•     1.1 材料与方法
•     1.2 结果
•     1.3 讨论
•     1.4 小结
•   第二章 狂犬病病毒CVS-11 株间隔区缩短的缺失株的特性研究
•     2.1 材料与方法
•     2.2 结果
•     2.3 讨论
•     2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨金金

导师: 扈荣良

关键词: 狂犬病病毒,基因间隔区,反向遗传系统,病毒拯救,重组病毒,直接免疫荧光

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000171

总页数: 54

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